多重实时荧光定量PCR检测急性肝炎患者HBV和HCV方法的建立与意义分析

目的建立一种新的可以快速筛查急性肝炎患者HBV和HCV感染的多重实时荧光定量PCR方法。方法收集596例急性肝炎患者血清或血浆样本,应用自主构建的多重实时荧光定量PCR方法同时检测HBV和HCV,同时应用HBV和HCV单管检测试剂进行检测分析。结果新建立的多重实时荧光定量PCR体系,可以有效地检测HBV和HCV的阳性质控品及阳性样本。多重实时荧光定量PCR体系特异性较好,检测HBV和HCV时,两者之间无交叉反应,且以多种血浆病毒的核酸样品为模板进行检测时结果全为阴性;多重实时荧光定量PCR体系检测HBV、HCV的灵敏度分别为20 IU/ml、50 IU/ml;多重实时荧光定量PCR体系精密度好,检测HBV、HCV的CV值分别为0.11%、0.096%。在检测临床样本时,多重复合体系检测血清或血浆中HBV和HCV的检出率与单独检测HBV和HCV具有很好的一致性,且HBV和HCV的一致率分别达到97.7%(k=0.952)、98.8%(k=0.976);同时有6例样本出现HBV和HCV共感染。结论新型多重实时荧光定量PCR方法对快速检测及筛查HBV和HCV较快捷,而且特异性好、灵敏度高、精密度好。因此多重实时荧光定量PCR方法对2种肝炎病毒的检测具有重要意义。     

带有CFP标签的LC3自噬表达载体的构建

目的构建带有樱桃红色荧光蛋白(cherry fluorescent protein,CFP)标签的微管相关蛋白1轻链3(LC3)自噬真核表达载体,并进行初步表达鉴定。方法采用PCR方法,从质粒载体pCMV-GFP-LC3为模板扩增LC3片段,通过T4 DNA连接酶将纯化后的PCR产物LC3与经过ApaI和BamHI双酶切的pm-cherry-c1载体连接,命名为PM-CFP-LC3。该载体经酶切及测序验证后,在fugene6转染试剂介导下转染293细胞,通过荧光显微镜观察CFP在细胞内的分布来观察LC3表达情况。结果带有CFP标签的LC3表达载体构建成功,在荧光显微镜下可观察到转染细胞中樱桃红色荧光以及细胞自噬现象。结论成功构建了带有CFP标签LC3的重组质粒并成功表达,为深入研究细胞的自噬奠定了实验基础。     

多重定量荧光PCR在21-三体及性染色体多倍体畸变诊断中的应用

目的探讨多重定量荧光PCR(QF-PCR)技术在染色体非整倍体畸变诊断中的应用价值。方法抽取脐血样本16份,羊水样本73份,21、X、Y染色体数目异常患者及其父母外周静脉血71份,针对21号染色体和X、Y染色体上7个基因位点21S1435、D21S11、D21S1411、AMXY、DXS981、DXS6809和X22应用QF-PCR方法进行多重扩增,毛细管电泳法检测并分析结果。所有样本同时进行染色体核型分析。结果染色体核型分析中有129例为正常核型46,XX(XY);26例21-三体(其中1例为易位型,余为标准型);1例45,XO/46,XX;2例47,XXX;1例47,XXY;1例45,XX,der(13,21)。QF-PCR结果中,确诊1例47,XXY,26例21-三体征中23例确诊,2例47,XXX被提示可能存在性染色体数目异常,其余为阴性结果。结论多重定量荧光技术可用于染色体非整倍体畸变的快速诊断。     

HIV-1感染者中枢神经系统的病毒学特征研究

目的 探讨HIV-1感染者中枢神经系统(CNS)的病毒学特征.方法 通过克隆测序分析病毒亚型,观察CNS中HIV-1变异性和离散率;依据V3环11/25法则并结合10例有偿献血HIV-1感染者尸检脑组织标本免疫荧光试验分析中枢神经HIV-1复合受体的使用.结果 有偿献血人群感染的HIV-1显示B和B’亚型特征,脑脊液(CSF)和外周血序列有嵌合现象;CSF C2-V5区序列变异性明显低于外周血,两者的离散率差异无统计学意义;依据11/25法则分析V3环序列可见中枢神经HIV-1大多数使用CCR5复合受体.结论 CNS HIV-1病毒变异性明显小于外周血;CNS HIV-1具有CCR5嗜性.     

应用MGB探针检测人乙型肝炎病毒的基因型

目的检测血浆或血清样本中人乙型肝炎病毒HBV的基因型,建立了基于MGB探针的实时荧光定量PCR检测体系。方法在HBV基因组型特异性碱基的聚集区域设计荧光定量PcR引物及探针。为保证特征特异性及高分辨率,选择设计MGB探针,然后将PCR扩增的产物纯化后进行基因克隆．克隆成功后提取的质粒制备为阳性质控品,从而建立完整的MGB探针法的荧光定量PCR检测体系,最后对该检测体系进行方法学评价。结果成功建立了基于MGB探针的HBV荧光定量PCR的基因分型检测体系。方法学评价显示,该检测体系的灵敏度达50IU／mL;重复性好;特异性良好,以多种血浆病毒的核酸样品为模板进行检测时结果全为阴性。结论本研究建立基于MGB探针的HBV荧光定量PCR的基因分型检测方法,可以很好地定性的检测血浆或血清样本及血液制品中的人乙型肝炎病毒HBV的基因型及含量,对于该疾病的临床治疗具有重要的意义。     

司他夫定中枢神经毒性研究

目的 探讨核苷类抗HIV药物司他夫定(D4T)的中枢神经毒性.方法 原代培养小鼠大脑皮层神经细胞,应用不同浓度D4T作用于细胞,采用乙酰甲氧基钙黄绿素-(AM)和碘化丙啶(PI)染色法检测神经细胞凋亡,免疫荧光法检测神经元细胞形态学变化,实时定量PCR检测环氧合酶-2 (COX-2)拷贝数来评估细胞线粒体DNA含量,同时检测胸苷激酶2(TK2) mRNA表达的变化.采用卡方检验、t检验和Wilcoxon非参数检验进行统计分析.结果 D4T 0 μmol/L组、D4T25 μmol/L组和D4T 50 μmol/L组凋亡细胞所占比例分别为24.9％±8.2％、26.5％ ±10.6％和51.3％±12.4％,后者与前两者比较,差异有统计学意义(x2=7.25、6.93,均P＜0.01).D4T0 μmol/L组、D4T 25μmol/L组和D4T 50 μmol/L组平均每个神经元神经突起的数量分别为11.2±3.6、8.6±2.8和4.3±2.4,D4T 25 μmol/L组与D4T 0μmol/L组、D4T 50 μmol/L组与D4T25 μmol/L组之间差异有统计学意义(t=4.06、4.35,均P＜0.01);D4T 0 μmol/L组、D4T 25 μmol/L组与D4T 50 μmol/L组神经突起长度分别为(319.9±100.2)、(298.3±83.9)和(258.4±82.2) μm,D4T 25 μmol/L组与D4T 0μmol/L组、D4T 50μmol/L组与D4T 25 μmol/L组之间差异有统计学意义(t=4.58、4.65,均P＜0.01).PCR相对定量显示,D4T 25 μmol/L组和D4T50μmol/L组TK2 mRNA拷贝数分别是D4T 0 μmol/L组的0.34和0.08倍,D4T 25mol/L组与D4T 0 μmol/L组、D4T 50 mol/L组与D4T 25 μmol/L组之间差异有统计学意义(Z=-3.28、-4.25,均P＜0.01);D4T 25μmol/L组和D4T 50 μmol/L组COX-2拷贝数分别是D4T 0 μmol/L组的1.01和1.12倍,D4T 25 μmol/L组与D4T 0 μmol/L组、D4T 50 μmol/L组与D4T 25 μmol/L组之间差异均无统计学意义(Z=0.98、1.24,均P＞0.05).结论 短期接触D4T可诱导神经元凋亡,抑制其突起形成,并可抑制TK2表达,但对线粒体含量无影响.     

增强型绿色荧光蛋白-神经标识真核表达载体构建及在细胞内的表达

目的 构建可转染神经胶质细胞和神经元的增强型绿色荧光蛋白-神经标识(EGFP-ID)真核表达载体,为神经突起损伤活体研究提供技术方法. 方法 采用PCR方法分别从质粒pEGFP-N1载体和大鼠脑组织基因组DNA中扩增EGFP和ID序列.通过T4 DNA连接酶将纯化后的PCR产物EGFP与经过BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切的pcDNA4.1-hisB载体连接.将经克隆测序确定的pcDNA4.1-EGFP经由NotⅠ和Xba Ⅰ双酶切并与纯化的PCR产物ID连接,再次克隆测序确定为pcDNA4.1-EGFP-ID.将pcDNA4.1-EGFP与pcDNA4.1-EGFP-ID在转染试剂Fugene6 介导下转染人神经胶质瘤U87细胞和小鼠原代培养神经元,通过倒置荧光显微镜观察EGFP在2种细胞内的分布.此外,用50 μmol/L核苷类似物司他夫定处理神经元8d,第8天末观察EGFP-ID 示踪细胞突起发育情况,并与免疫荧光检测结果作比较. 结果 成功扩增得到EGFP和ID基因片段,重组得到EGFP-ID真核表达载体,该载体携带的EGFP基因在U87细胞和神经元内表达并布满细胞突起,示踪神经元突起形态变化的结果与免疫荧光观察结果一致. 结论 pcDNA4.1-EGFP-ID能够介导EGFP基因在神经元和胶质细胞突起内表达,从而直观再现神经突起形态特征.     

短期使用齐多夫定抑制p53R2表达及诱导小鼠神经元凋亡的研究

目的探讨齐多夫定(AZT)的中枢神经毒性及其相关机制。方法原代培养小鼠大脑皮层神经元,分别用0 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L的AZT作用于细胞,TUNEL法检测细胞凋亡,免疫荧光观察细胞形态,实时定量PCR(qPCR)检测依赖p53的p53R2、抑癌基因p21、胸苷激酶(TK2)mRNA表达及线粒体DNA含量,蛋白印迹检测p53R2与p21蛋白的表达。结果 AZT 0mmol/L组(对照组)、50 mmol/L组和100 mmol/L组细胞凋亡率分别为(11.9±3.37)%、(24.3±8.94)%和(54.7±17.9)%,差异具有统计学意义(χ2=5.19、19.33,P均0.01);突起长度分别为(869.21±177.75)mm、(495.76±175.20)mm和(120.38±47.12)mm,且差异均具有统计学意义(F=19.558,P=0.002);real-time qPCR检测结果显示AZT 50 mmol/L和100 mmol/L组p53R2、TK2 mRNA拷贝数分别是对照组的0.42和0.04倍、0.52和0.29倍,组间差异均具有统计学意义(Z=-4.54、-6.65、-4.33和-5.24,P均0.01);AZT 50 mmol/L和100 mmol/L组p21 mRNA拷贝数分别是对照组的0.98和0.86倍,差异无统计学意义(P0.05)。线粒体含量用环氧化酶2(COX-2)拷贝数评估,AZT 50 mmol/L组和100 mmol/L组分别是对照组的0.92和0.87倍,差异无统计学意义(P0.05)。蛋白印迹显示对照组、AZT 50 mmol/L组和100 mmol/L组p53R2蛋白含量依次降低,而p21蛋白含量无差异。结论 AZT可诱导神经元凋亡,抑制突起形成,推测其机制与p53R2表达降低有关。短期接触AZT可抑制TK2的表达,但对线粒体DNA含量无影响。     

HIV感染儿童抗病毒治疗后外周血单个核细胞的TK2表达水平及意义

目的探讨艾滋病病毒(HIV)感染儿童抗病毒治疗后外周血单个核细胞(PBMC)中潜在线粒体毒性标志物表达水平及其相关机制。方法选择60例抗病毒治疗的HIV感染儿童和20例健康儿童,检测PBMC中胸苷激酶2(TK2)基因的mRNA和蛋白质表达水平变化,与治疗方案及治疗时间的相关性分析。结果 HIV感染患儿抗病毒治疗的PBMC中TK2基因mRNA和蛋白质表达水平显著高于对照组儿童(mRNA:2.45/1,蛋白质:3.2/1)差异均有统计学意义(P<0.05)。随着治疗时程的增加,司他夫定治疗组较齐多夫定治疗组的TK2蛋白质水平增加更显著(P<0.05)。将患儿分别按基线CD4+T淋巴细胞计数、基线病毒载量、性别、年龄以及HIV传播途径进行分组比较,各组患儿间TK2水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论外周血PBMC的TK2水平可反映儿童抗病毒治疗后的线粒体毒性,有望成为线粒体毒性检测指标。