变形链球菌ComE蛋白在大肠杆菌中的高效表达与纯化

目的:构建变形链球菌comE基因原核表达载体,诱导ComE 融合蛋白高效表达,获取高质量的ComE 融合蛋白.方法:提取变形链球菌基因组,PCR 扩增得到变形链球菌comE基因片段,BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后定向克隆到pET28a(+) 表达载体中,并转化入E. Coli BL21(DE3).IPTG 诱导融合蛋白表达,Western blot 鉴定表达产物.进行蛋白表达的可溶性鉴定,并优化诱导时菌液的A600值、IPTG 浓度、诱导时间和温度4 个表达条件.然后用优化的条件大量诱导表达ComE 融合蛋白,采用镍柱和分子筛两步法进行纯化.结果:经PCR、双酶切反应以及测序鉴定,重组质粒中的插入序列为comE基因的全长片段(753 bp),无碱基的突变与读码框架的偏移.Western blot 证实表达产物确为6×His-ComE 融合蛋白,相对分子质量约为33 000.目的蛋白在上清和沉淀中均有表达,且当A600 为0.4 时,加入IPTG 至终浓度0.10 mmol/L,37 ℃诱导4 h后表达量最大.结论:成功构建pET28a(+)-comE 原核表达载体,用优化后的6×His-ComE 融合蛋白在E. Coli BL21(DE3) 中的表达条件,获得纯化的变形链球菌ComE 融合蛋白.     

变形链球菌UA159磷酸蔗糖变位酶基因功能丧失菌株的构建

目的:构建变形链球菌UA159磷酸蔗糖变位酶基因(phospho-sugar mutase gene,psm)功能丧失菌株,为进一步研究变形链球菌psm功能做准备.方法:将变形链球菌UA159 psm内部上、下游2段序列分别克隆至自杀质粒pFW5的2个多克隆位点(MCS-Ⅰ和MCS-Ⅱ),构建重组质粒,并经酶切和测序证实.利用同源重组(homologous recombination)原理,采用自然转化的方法,实现重组自杀质粒和变形链球菌UA159同源序列的等位交换(allelic exchange).结果:经过PCR和测序分析,证实变形链球菌UA159基因组中的psm被重组质粒的基因(含有壮观霉素抗性)取代.结论:成功构建了变形链球菌UA159 psm功能丧失菌株.     

利用DGGE分析无龋和有龋儿童牙菌斑细菌组成

目的:通过变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技术分析无龋(caries free,CF)儿童和重型早期婴幼儿龋(severe early childhood caries,SECC)儿童集合牙菌斑内细菌多样性的差异。方法:无龋儿童和SECC儿童各34例,牙菌斑基因组DNA等量混合后,制备无龋和SECC儿童牙菌斑基因组库,进行全基因组放大。分别以放大前后的基因组为模板,PCR扩增16S rDNA的V2-V3区,DGGE分析,切取SECC样本的特异条带进行克隆、测序、核酸序列比对。结果:基因组在放大前后DGGE图谱一致,SECC组样本的条带数多于CF组的条带数。切取的SECC样本的4条特异条带测序后证实为3种未培养微生物和嗜沫嗜血杆菌。结论:利用DGGE技术发现了SECC儿童菌斑与CF儿童菌斑细菌组成的差异,并在SECC样本中发现了区别于CF样本的未培养微生物,这些微生物在致龋过程中发挥的作用还有待研究。     

变形链球菌thrS基因生物信息学分析及同源重组质粒的构建

背景:变形链球菌是公认的主要致龋菌,细菌的黏附、生物膜形成、产酸、耐酸等各个表型都与细菌的致龋性相关.有研究结果提示,苏氨酰-tRNA合成酶基因(threonyl-tRNA synthetase,thrS)可能与变形链球菌的黏附、产酸、耐酸等致龋性表型相关.目的:对苏氨酰tRNA合成酶基因进行保守性分析,构建用于变形链球菌苏氨酰-tRNA合成酶基因敲除的重组质粒.方法:首先通过生物信息学结合Southern Blot对苏氨酰-tRNA合成酶基因的保守性进行分析,再将变形链球菌苏氨酰-tRNA合成酶基因上下游序列分别克隆至自杀质粒pFW5上的多克隆位点,构建用于基因敲除的重组质粒.观察苏氨酰-tRNA合成酶基因的保守性及重组质粒的构建结果.结果与结论:苏氨酰-tRNA合成酶基因在实验中所列6种变形链球菌中保守存在:经过聚合酶链反应和酶切分析,重组质粒所插入片断无误.表明重组质粒pFW5-thrS构建成功.重组质粒pFW5-thrS的构建可用于今后变形链球菌苏氨酰-tRNA合成酶基因功能的研究.     

变形链球菌生物膜形成相关基因的研究进展

变形链球菌是公认的主要致龋菌，其重要的毒力因子之一就是在牙表面形成生物膜。生物膜的形成是变形链球菌在牙面聚集生存以及致龋所必需的结构。本文综述了变形链球菌当中与生物膜形成相关的基因，以期为防龋研究提供新的思路。     

构建变形链球菌psm基因同源重组质粒的实验

背景:为了深入研究磷酸蔗糖变位酶基因psm与变形链球菌S.mutans致龋性之间的关系,需要利用同源重组原理构建psm基因功能丧失菌株,因此构建一个符合同源重组条件的合格质粒载体就成为实验工作的重要前提.目的:构建变形链球菌S.Mutans UA159 psm的两种同源重组质粒.设计、时间及地点:于2005-12/2006-07在北京大学医学部病原微生物实验室完成的单一样本观察实验.＃材料:实验所用口腔链球菌均来自四川大学华西口腔医学院微生物实验室.方法:首先应用Southern Blot对psm基因的保守性进行分析,再将S.Mutans UA159 psm基因内部序列分别克隆至自杀质粒pSF151和pVA981上的多克隆位点,构建重组质粒.主要观察指标:psm基因的保守性及重组质粒pSF151及pVA981的构建结果.结果:psm基因在实验中所列8种S.Mutans中保守存在;经过聚合酶链反应和酶切分析,两个重组质粒所插入片断无误.重组质粒pSF151(空质粒大小为3.5kbp)和pVA981(空质粒大小为7.1kbp)构建成功.结论:两种可以用于转化S.Mutans UA159的重组质粒的构建可用于今后S.Mutans UA159 psm基因功能的研究,且重组质粒大小是否影响转化效率需后续观察.     

一种低温等离子体针对变形链球菌杀灭效果的研究

目的研究低温等离子体针对口腔变形链球菌及其生物膜的杀灭效果。方法用载体定量杀菌试验方法和扫描电镜技术,对低温等离子体针杀菌效果进行了实验室观察。结果琼脂培养基平板上变形链球菌经激发电压1 870 V、照射距离1.5 cm、低温等离子体针处理20 s,等离子体针处理形成直径约7 mm的圆形细菌杀菌圈。染菌载体经等离子体针照射20 s,对载体上变形链球菌平均杀灭对数值为1.87;照射100 s,平均杀灭对数值为2.48。在激发电压为2 550 V时,距离1.5 cm处理20 s条件下,等离子体针对玻片上变形链球菌生物膜平均杀灭对数值为3.43。结论低温等离子体针可快速有效地杀灭变形链球菌,随照射时间延长杀菌效果提高。     

变形链球菌thrS基因生物信息学分析及同源重组质粒的构建

背景：变形链球菌是公认的主要致龋菌，细菌的黏附、生物膜形成、产酸、耐酸等各个表型都与细菌的致龋性相关。有研究结果提示，苏氨酰-tRNA合成酶基因(threonyl-tRNA synthetase, thrS)可能与变形链球菌的黏附、产酸、耐酸等致龋性表型相关。 目的：对苏氨酰-tRNA合成酶基因进行保守性分析，构建用于变形链球菌苏氨酰-tRNA合成酶基因敲除的重组质粒。 方法：首先通过生物信息学结合Southern Blot对苏氨酰-tRNA合成酶基因的保守性进行分析，再将变形链球菌苏氨酰-tRNA合成酶基因上下游序列分别克隆至自杀质粒pFW5上的多克隆位点，构建用于基因敲除的重组质粒。观察苏氨酰-tRNA合成酶基因的保守性及重组质粒的构建结果。 结果与结论：苏氨酰-tRNA合成酶基因在实验中所列6种变形链球菌中保守存在；经过聚合酶链反应和酶切分析，重组质粒所插入片断无误。表明重组质粒pFW5-thrS构建成功。重组质粒pFW5-thrS的构建可用于今后变形链球菌苏氨酰-tRNA合成酶基因功能的研究。