HPV58E6基因的克隆及体外表达

目的克隆并体外表达HPV58E6,为E6致癌作用和疫苗的研究奠定基础.方法通过PCR方法从HPV58全基因克隆中扩增出HPV58E6基因片段,利用基因重组技术,将其克隆至真核表达质粒pcDNA3的T7启动子下游,体外转录成mRNA后,在源自网织红细胞的翻译缓冲液中表达生物素标记的HPV58E6蛋白,化学发光法检测,X光胶片曝光显影鉴定.结果酶切电泳证实质粒构建正确,SDS-PAGE电泳显示在相当于HPV58E6分子量约18.8kD的位置出现条带,X光胶片亦在相应位置出现印迹条带.结论成功表达了含有生物素标记的HPV58E6蛋白,为其致癌作用和治疗的研究奠定基础.     

加强实验教学改革，提高医学微生物学教学质量

为提高医学微生物学实验教学质量,激发学生学习兴趣、培养科学思维、掌握实验操作技能,进行了一些改革和探索。文章从整合实验教学内容,开发综合性试验;引入设计性实验教学法,发挥学生主观能动性;加强实验室建设,重视生物安全方面以及改进实验教学手段,增添实验内容等方面进行了阐述。     

SARS冠状病毒M基因片断在大肠杆菌中表达及其抗原性的研究

目的：获得纯的重组SARSCoV M蛋白，并初步测定重组蛋白的抗原性。方法：软件分析SARSCoV M蛋白富含免疫表位的片断，体外合成编码SARSCoV M蛋白15．170aa序列的DNA片段，利用DNA重组技术，将该合成DNA克隆至表达载体pGEX-5X-1，构建重组质粒pGEX．SARSCoV M。在大肠杆菌BL2l中诱导表达GST-SARSCoV M重组融合蛋白，分离纯化GST-SARSCoV M蛋白，利用纯化蛋白作为抗原，建立ELISA试验检测抗SARSCoV M抗体。结果：GST-SARSCoV M蛋白分子量为43kD，纯化的GST-SARSCoV M蛋白作为抗原检测血清中SARSCoV M抗体，53例正常成人献血者血清未检出SARSCoV M抗体。结论：SARSCoV M蛋白表达成功，在健康人血清中未检出SARSCoV M抗体。     

E型沙眼衣原体MOMP基因重组质粒的构建与表达

目的：构建E型沙眼衣原体（Ct）主要外膜蛋白（MOMP）基因重组真核表达质粒pVAX1-MOMP,为探索安全的E型CtDNA疫苗奠定基础。方法：根据Genebank中E型Ct MOMP基因序列设计引物,用高保真PCR方法从E型Ct基因组DNA中扩增得到约1.1kb的MOMP片段,克隆至pcDNAⅡ载体,测序后亚克隆至表达载体pVAX1,构建卡那霉素抗性真核重组表达质粒pVAX1-MOMP,并以重组质粒转染COS-1细胞进行表达,用Western blotting方法鉴定表达产物。结果：从E型Ct基因组DNA中扩增出特异的MOMP基因片段,酶切鉴定及DNA序列测定证实pVAX1-MOMP重组质粒构建正确,能在COS-1细胞内表达,表达产物能与抗MOMP单克隆抗体特异性结合。结论：成功构建E型沙眼衣原体MOMP真核表达质粒pVAX1-MOMP,并在真核细胞内获得表达。     

巨细胞病毒感染人脐静脉内皮细胞后RAGEmRNA的时序性表达及其意义

目的：研究人巨细胞病毒(HCMV)感染对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)糖基化终产物受体(RAGE)表达的影响，探讨HCMV感染致动脉粥样硬化的作用机制。方法：用HCMV感染HUVEC，采用RT PCR方法检测不同感染时段细胞RAGEmRNA的表达。结果：HCMV感染HUVEC后，0?h时RAGEmRNA有基础水平的表达，4?h开始升高，8?h时表达水平明显升高，随感染时间延长，表达量逐渐增高，感染24?h时达高峰，48?h开始回落，72?h表达量仍维持在较高的水平，显著高于0?h。各时段与0?h比较，均有统计学意义(P＜0.01)。结论：HCMV感染人脐静脉内皮细胞后能够促进RAGE mRNA的表达，并且呈时间依赖性。HCMV有可能通过上调RAGE介导内皮细胞的炎症反应，促进动脉粥样硬化的发生、发展。     

医学微生物学实验线上教学的实践与思考

针对医学微生物学实验线上教学面临的诸多难题,本研究采取线上直播+操作视频+虚拟实验的授课模式,通过操作视频和虚拟实验弥补了操作上的缺口;考核模式采用紧扣操作流程的主观型思考题+实验设计+文献综述（围绕传统实验由于条件所限无法开展的临床检验重头技术或新技术,如质谱分析、荧光定量PCR、G实验等展开）的模式,从而可以较大限度了解学生对教学目标的掌握程度和综合应用、创新性思维等能力。学生调查问卷显示,大部分学生对线上实验教学模式持肯定态度,学生作业的完成质量表明大部分学生学习效果良好。     

医学微生物学实验线上教学模式探索与思考

医学微生物学实验作为一门实践课,开展线上教学面临诸多难题。基本技能的掌握和动手能力的提高是实验课的核心培养目标。缺少了实地操作,线上实验教学在授课模式和考核模式上都面临较大挑战。我们采取线上直播+操作视频+虚拟实验的授课模式,通过操作视频和虚拟实验在一定程度上弥补操作上的缺口。考核模式采用紧扣操作流程的主观型思考题+实验设计+文献综述(围绕传统实验由于条件所限无法开展的临床检验重头技术或新技术如质谱分析、荧光定量PCR、G实验等展开)的模式,从而可以较大限度了解学生对教学目标的掌握程度和综合应用、创新性思维等能力,在较大程度上弥补了操作考试缺席的不足。对学生进行的随机调查问卷结果显示,大部分学生对本次线上实验教学模式持肯定态度。学生作业的完成质量表明大部分学生学习效果良好。     

HPV16 L1-E7蛋白疫苗诱导小鼠产生抗体及细胞免疫应答的研究

目的：探讨嵌合性病毒样颗粒HPV16 L1－E7蛋白疫苗接种于动物体内诱发体液和细胞免疫反应的能力。方法：以本室构建的HPV16 L1－E7嵌合蛋白疫苗腹腔注射免疫BALB／c小鼠，在初次免疫后，分别于第3，4，5周采血ELISA检测特异性抗体的产生。并耳皮下注射HPV16L1蛋白，检测特异性DHT反应，在末次免疫2周后，取小鼠脾细胞，用HPV 16 L1－E7蛋白刺激，检测T细胞增殖反应及血清IFN－γ水平。结果：HPV16 L1－E7蛋白疫苗免疫小鼠可有效产生HPV16 L1抗体及特异性DTH反应，加强免疫后，抗体水平升高，两者水平均高于对照组（P＜0．01），HPV16 L1－E7嵌合蛋白疫苗免疫后取小鼠脾细胞，在特异性HPV16 L1－E7蛋白抗原刺激下，特异性T淋巴细胞明显增殖，被免疫小鼠血清中出现高水平IFN－γ。结论：嵌合母亲产颗粒HPV16 L1－E7蛋白可诱导小鼠产生高滴度抗体，HPV16L1特异性TDH参与的超敏反应及细胞免疫应答的细胞因子，这为研究预防HPV感染和治疗HPV相关性肿瘤的疫苗提供了实验资料。     

HPV16L1-E7重组腺病毒载体疫苗免疫BALB/c小鼠的研究

目的:探讨人乳头瘤病毒16型L1-E7重组腺病毒载体疫苗的免疫效应。方法:①将rAd5HPV16L1-E7载体疫苗在293细胞中扩增后,以肌肉注射、腹腔注射、滴鼻和灌胃途径免疫小鼠,采用ELISA法测其血清IgG抗体水平;②制备脾细胞悬液,加入到96孔无菌培养板中,并分别加入rAd5HPV16L1-E7特异性蛋白和RPMI1640 10%胎牛血清,加入3H-TdR1μCi/孔,做T-细胞增殖实验;③取经过培养56h的培养液进行IFN-γ的测定。结果:不同途径免疫的BALB/c小鼠血清IgG抗体水平均高于对照组(P<0.05),但以肌注组产生抗体量最多,IFN-γ和T-细胞增殖亦高于对照组(P<0.05)。结论:rAd5HPV16L1-E7重组活病毒疫苗既能刺激T-细胞产生细胞介导的免疫应答,又能刺激B-细胞产生抗体介导的免疫应答,说明其具有很好的免疫原性。