传染病背后的科学——从“N个第一”的诞生到传染病的防治

现今世界上发达国家的人均寿命已经超过80岁,然而19世纪以前,人类的平均寿命仅有30~40岁,传染性疾病是当时占据首位的死亡原因。一个多世纪以来,人类寿命和健康水平的提高,得益于疫苗和药物的诞生,而在发现和发明这些具有里程碑式的“灵丹妙药”背后,是一场科学的革命。本文对从巴斯德革命性科学“微小生命体理论”的提出,到“细菌致病理论”的建立,到由此诞生的N个控制传染病的“灵丹妙药”发现和发明,进行了比较全面的文献梳理和阐述。旨在让读者在“身临其境”的COVID-19传染病大流行期间,能够重温一下在抗击“瘟疫”的历史长河中诞生的革命性的科学和伟大的科学家,并致敬各行各业为抗击疫情而努力的人们。     

灵芝锰过氧化物酶毕赤酵母工程菌培养条件的优化

目的 研究毕赤酵母生产重组灵芝锰过氧化物酶(recombinant Ganoderma lucidum manganese peroxidase,rG1MnP)的最优培养条件.方法 在单因素实验基础上,采用中心组合设计和响应曲面法对rGlMnP工程酵母产rGlMnP的发酵条件进行优化,探讨初始pH、温度、甲醇浓度和血红素浓度对重组毕赤酵母生产的rGlMnP的酶活力的影响,分析上述4个因子的交互作用及其最佳水平范围,并验证模型的有效性.结果 初始pH、温度、甲醇浓度和血红素浓度对毕赤酵母生产rGlMnP的酶活力有显著影响;毕赤酵母生产rGlMnP最优的培养条件为:初始pH5.5、诱导温度30℃、甲醇浓度1.5％以及血红素浓度1.0 mmol/L.结论 本研究为利用毕赤酵母工程菌大规模生产rGlMnP奠定了基础.     

小鼠骨髓抑制和再生过程中Sod/Gpx/Cat抗氧化酶基因的动态表达研究

 目的 研究 Sod/Gpx/Cat 抗氧化酶系列基因在小鼠骨髓抑制和再生过程中的动态表达，了解氧化应激在骨髓再生过程中的作用。 方法 制备经 5-氟尿嘧啶（5-Fu）注射后的骨髓抑制和再生 C57BL/6 小鼠模型，分别在 5-Fu注射前（第 0 天）和注射后第 3、7、11、14 天各断颈处死 6 只小鼠（分别记为 0 d 组、3 d 组、7 d 组、11 d 组、14 d 组），收集小鼠骨髓单核细胞。Trizol 试剂抽提小鼠骨髓单核细胞总 RNA，采用 Affymetrix 小鼠全基因组 cDNA 430A 芯片检测小鼠骨髓细胞 Sod/Gpx/Cat 系列基因的表达，并对检测结果进行半定量 RT-PCR 鉴定。 结果 Sod1/Sod2/Gpx1/Gpx3b/Gpx4b/Cat 在各组小鼠骨髓细胞中均有较高的表达，Sod3/Gpx2 则在 7 d 组开始表达，11 d 组和 14 d 组表达量持续减少。其中 Sod2/Gpx3b/ Gpx4b/Cat 从 0 d 组到 14 d 组均为表达量先增加后减少；Sod1/Gpx1 则为表达量先减少后增加；在各组小鼠骨髓细胞中未检测到 Gpx3a/Gpx4a/Gpx5/Gpx6 的表达。 结论 Sod/Gpx/Cat 抗氧化酶系列基因在小鼠骨髓抑制和再生过程中呈现特征性的动态变化，这种变化提示了骨髓细胞氧化应激反应过程的组织特异性和调控特定的细胞信号通路的过程。     

体内表达谷胱甘肽过氧化物酶-7型基因对骨髓抑制的防护作用研究

 目的 探讨体内表达谷胱甘肽过氧化物酶-7 基因（Gpx-7）对 5-氟尿嘧啶（5-Fu）引发小鼠骨髓抑制的防护作用。方法 以尾静脉注射5-Fu（250 mg/kg）的方法建立小鼠骨髓抑制和再生模型。5-Fu 注射后第 1 天，通过电穿孔转染法将 pcDNA3.1- Gpx7 重组质粒 50 μg 注入小鼠胫前肌（实验组），以 pcDNA3.1 空质粒载体 50 μg 电穿孔转染作为对照组，每组各 30 只小鼠。 5-Fu 注射前和注射后 3、7、11、14 d，2 组各断颈处死 6 只小鼠，计数小鼠外周血白细胞数、血小板数和单条腿骨髓细胞总数；然后分别取 5-Fu 注射后 7、14 d 断颈处死小鼠各 3 只进行骨髓细胞集落形成试验；并分别取 5-Fu 注射前和注射后 3、7、11、14 d 断颈处死的小鼠各 1 只制备完整大腿骨石蜡组织切片，观察骨髓组织形态学的变化。结果 注射 5-Fu 后 11 和 14 d，实验组外周血白细胞数分别为（3917 ± 733）和（6857 ± 1878）/μl，均明显高于同时点对照组[分别为（2683 ± 920）和（4017 ± 1011）/μl，均 P < 0.05）]；注射 5-Fu 后 11 d，实验组外周血小板数为（150.8 ± 64.3）万/μl，明显高于同时点对照组[（63.0 ± 60.3）万/μl，P < 0.05）]；注射 5-Fu 后不同时间 2 组间单条腿骨髓细胞总数差异无统计学意义。注射 5-Fu 后 7、14 d，2 组之间骨髓细胞集落形成数差异无统计学意义。 实验组注射 5-Fu 后 11 d 小鼠的骨髓组织形态恢复程度与对照组注射 5-Fu 后 14 d 小鼠类似；注射 5-Fu 后 14 d 小鼠的骨髓组织形态接近注射前。 结论 体内表达 Gpx-7 基因可以促进被化疗药物 5-Fu 抑制的小鼠骨髓再生。     

抗铜绿假单胞菌PcrV的scFv-Fc抗体的制备及体外活性研究

目的 制备靶向铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)III型分泌系统组件蛋白PcrV的scFv-Fc形式的单克隆抗体MFa,并研究其体外对铜绿假单胞菌生物膜形成及细胞黏附和侵入的影响。方法 将编码MFa的DNA序列合成后,插入到真核表达载体中,获得重组质粒,再采用聚乙烯亚胺(PEI)将质粒转染HEK293E细胞并获得瞬时表达;表达的产物通过HiTrap MabSelect SuRe柱进行纯化,所得到的抗体采用SDS-PAGE分析纯度,采用BCA法测定蛋白浓度。为了检测MFa抗体与PcrV抗原的亲和力,对PcrV抗原进行表达纯化,方法是将PcrV目的序列插入到pET28a表达载体中,转化E. coli BL21(DE3)获得宿主菌,在0.5mmol/L IPTG 15℃的条件下诱导过夜,并通过His-Tag标签进行亲和纯化。对于纯化的MFa抗体与PcrV抗原通过Western blot、ELISA、SPR(表面等离子共振)研究抗体与抗原的亲和力,并研究抗体体外对生物膜形成的影响,对铜绿假单胞菌黏附与侵入HeLa细胞的影响。结果 MFa抗体在HEK293瞬转系统成功获得表达与纯化,且对PcrV蛋白具有较好的亲和活性,KD值为492.2nmol/L。功能实验证实,MFa抗体能够降低铜绿假单胞菌生物膜的形成,降低铜绿假单胞菌对HeLa细胞黏附与侵入作用。结论 靶向PcrV的scFv-Fc抗体MFa具有对铜绿假单胞菌引起的感染的潜在效用,具有进一步开发为抗铜绿假单胞菌治疗药物的价值。     

抗体偶联抗菌药物的研究进展

细菌耐药性是21世纪全球关注的热点。随着细菌的耐药性问题凸显，作为大分子药物的抗体和疫苗，有望作为抗耐药菌感染的新一代药物。抗体偶联抗菌药物(antiboy-antibiotic conjugates, AAC)是在抗体偶联(抗肿瘤)药物(antibody-drug conjugates, ADC)基础上研发的一类新型抗耐药菌感染的药物，其具有ADC研发的基本理念，但也具有作为抗菌药物的特殊要求。本文就AAC最新进展做一综述。     

体内表达谷胱甘肽过氧化物酶-7基因对骨髓抑制的防护作用研究

目的 探讨体内表达谷胱甘肽过氧化物酶-7基因(Gpx-7)对5-氟尿嘧啶(5-Fu)引发小鼠骨髓抑制的防护作用.方法 以尾静脉注射5.Fu(250 mg/kg)的方法建立小鼠骨髓抑制和再生模型.5-Fu注射后第1天,通过电穿孔转染法将pcDNA3.1-Gpx7重组质粒50 μg注入小鼠胫前肌(实验组),以pcDNA3.1空质粒载体50μg电穿孔转染作为对照组,每组各30只小鼠.5-Fu注射前和注射后3、7、11、14 d,2组各断颈处死6只小鼠,计数小鼠外周血白细胞数、血小板数和单条腿骨髓细胞总数;然后分别取5-Fu注射后7、14 d断颈处死小鼠各3只进行骨髓细胞集落形成试验;并分别取5-Fu注射前和注射后3、7、11、14d断颈处死的小鼠各1只制备完整大腿骨石蜡组织切片,观察骨髓组织形态学的变化.结果 注射5-Fu后11和14 d,实验组外周血白细胞数分别为(3917±733)和(6857±1878)/μl,均明显高于同时点对照组[分别为(2683±920)和(4017±1011)/μl,均P<0.05)];注射5-Fu后11 d,实验组外周血小板数为(150.8±64.3)万/μl,明显高于同时点对照组[(63.0±60.3)万/μl,P<0.05)];注射5-Fu后不同时间2组间单条腿骨髓细胞总数差异无统计学意义.注射5-Fu后7、14 d,2组之间骨髓细胞集落形成数差异无统计学意义.实验组注射5-Fu后11 d小鼠的骨髓组织形态恢复程度与对照组注射5-Fu后14 d小鼠类似:注射5-Fu后14 d小鼠的骨髓组织形态接近注射前.结论 体内表达Gpx-7基因可以促进被化疗药物5-Fu抑制的小鼠骨髓再生.     

多聚乙烯基亚胺介导的pOSP1-HSVtk基因对卵巢癌的抗瘤研究

目的: 研究多聚乙烯基亚胺(PEI)介导的卵巢特异性启动子调控下的自杀基因对卵巢癌的抗肿瘤作用.方法:(1)将卵巢特异性启动子调控下的真核表达质粒pOSP1-HSVtk利用PEI导入人卵巢癌细胞SKOV3,人肺癌细胞NCI-H460和人肝癌细胞HepG2,MTT法测定GCV对三种肿瘤细胞的杀伤作用;(2)建立卵巢癌移植瘤模型,瘤周注射PEI/pOSP1-HSVtk复合物,通过HPLC监测体内GCV浓度的变化来评价TK基因在肿瘤组织中的表达效率;同时记录裸鼠的体重、瘤体大小及瘤重,计算体积和重量抑瘤率,并进行肿瘤组织的病理学和TUNEL检测.结果: (1)GCV仅对SKOV3细胞具有杀伤作用;(2)与对照组相比,GCV的浓度在转染pOSP1-HSVtk的肿瘤组织局部显著降低(0.05>P>0.01);治疗组的肿瘤体积和瘤重显著减小(P<0.01),体积抑瘤率与重量抑瘤率分别为63.66%和58.98%.组织学示治疗组肿瘤细胞有出血及坏死,TUNEL证实了细胞的凋亡.结论: 多聚乙烯基亚胺介导的卵巢特异性启动子调控下的自杀基因对卵巢癌有靶向杀伤作用.     

雷珠单抗的大肠埃希菌胞外分泌表达、纯化及结构表征

抗血管内皮细胞生长因子(VEGF)抗体可抑制新生血管的形成和生长,在年龄相关性黄斑变性眼科疾病的临床治疗中具有重要应用价值,特别是已上市的商品名为雷珠单抗的VEGF抗体Fab片段,在市场上取得巨大成功。本研究探索了雷珠单抗在大肠埃希菌中的胞外分泌表达技术,所表达的产品利用SDS-PAGE、Western Blot、肽谱图全序列分析和纳米差示扫描量热法(Nano DSC)等手段进行了初步的结构表征。结果显示,本研究成功实现了雷珠单抗的大肠埃希菌胞外分泌表达,经过进一步的Capto L亲和色谱获得了有正确氨基酸序列的Fab产品,经质谱分析具有正确的二硫键配对,且具有与标准品相似的热稳定性,为其进一步的工业生产奠定了基础。