幽门螺杆菌cagA基因片段原核表达载体的构建及其cagA基因和CagA蛋白及感染者血清抗体的检测

目的:构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)cagA基因片段的原核表达系统,建立ELISA检测CagA及其抗体,了解表达CagA的Hp菌株(CagA Hp)感染与所致疾病种类的关系.方法:从快速尿素酶试验阳性的156例患者胃黏膜活检标本中分离Hp.采用PCR检测109株Hp cagA基因,并从临床菌株Y06中扩增2 148 bp的cagA基因片段(cagA1).构建cagA1原核表达系统,用SDS-PAGE检查目的重组蛋白(rCagA1)的表达情况,用Western blot和免疫双扩散试验鉴定rCagA1的免疫反应性和抗原性.建立ELISA,检测109株Hp CagA表达和相应患者血清中CagA抗体.分析CagA Hp感染与胃炎和消化性溃疡的关系.结果:80.8%胃黏膜活检标本中分离出Hp(126/156),97.2%的Hp菌株(106/109)cagA基因阳性.与文献报道比较,所克隆的cagA1片段核苷酸和氨基酸序列同源性分别为94.83%和93.30%.所构建的原核表达系统表达的rCagA1量约为细菌总蛋白的30.0%.rCagA1能与Hp全菌抗体发生结合反应,免疫家兔产生双扩散效价为1∶4的抗体.92.6%菌株(101/109)可表达CagA,88.1% 患者(96/109)血清CagA抗体阳性.消化性溃疡标本中CagA Hp菌株分离阳性率(97.9%)高于胃炎标本(88.5%),但无统计学差异(χ2=3.48,P>0.05).结论:本实验构建的原核表达系统表达的rCagA1有良好的免疫反应性和抗原性,建立的ELISA可用于Hp CagA及其抗体的检测,分离的Hp菌株cagA基因携带率和CagA表达率均很高.消化性溃疡和胃炎与其感染的Hp是否表达CagA无明显关系.     

问号钩端螺旋体属lipL32/1-ompL1/1融合基因的真核表达及其表达产物的免疫反应性

目的:构建问号钩端螺旋体(简称钩体)的融合基因lipL32/1-ompL1/1真核表达系统并鉴定表达产物的免疫反应性.方法:采用连接引物PCR构建融合基因lipL32/1-ompL1/1,克隆测序后构建lipL32/1-ompL1/1的毕赤酵母真核表达系统pPIC9K-lipL32/1-ompL1/1-P.pastorisGS115.用MM和MD平板分离His Mut 型菌落,YPD平板筛选出G418高抗性的His Mut 转化子.以酵母裂解酶处理的高拷贝转化子His Mut 克隆裂解产物为模板,5'AOX1和3'AOX1为引物,用PCR检测所构建的毕赤酵母工程菌株染色体DNA中的目的融合基因.在BMMY培养基中用甲醇诱导目的重组蛋白rLipL32/1-rOmpL1/1表达.采用硫酸铵沉淀,Ni-NTA亲和层析提纯培养物上清液中的rLipL32/1-rOmpL1/1.采用SDS-PAGE和Western blot分别检测rLipL32/1-rOmpL1/1的产量及其免疫反应性.结果:获得的lipL32/1-ompL1/1融合基因约为1 794 bp.其核苷酸和氨基酸序列与原始lipL32/1和ompL1/1基因型比较,相似性分别高达99.94%和100%.所构建的真核表达系统可分泌rLipL32/1-rOmpL1/1,SDS-PAGE后位于预期位置处,产量约占上清总蛋白的40%.rLipL32/1和rOmpL1/1兔抗血清均能与表达的rLipL32/1-rOmpL1/1结合.结论:本研究成功地构建了钩体lipL32/1-ompL1/1融合基因高效毕赤酵母真核表达系统,所表达的融合蛋白具有特异的免疫反应性,可作为研制钩体新疫苗的候选抗原.     

钩端螺旋体属特异性外膜蛋白抗原的分析

致病性问号钩端螺旋体(简称钩体)血清群众多,各群间交叉保护作用较弱或无,目前国内外均采用当地流行的钩体血清群来制备多价钩体疫苗,但对疫苗中未包含钩体血清群感染的保护作用极其有限,易造成钩体病的暴发流行。已知80℃灭活、生理盐水回收的腐生性双曲钩体PatocⅠ株全细胞抗原(TR PatocⅠ)能与所有钩体病人血清发生凝集反应,但其抗血清能否凝集不同血清群的问号钩端螺旋体尚不清楚。本研究中,我们采用TR PatocⅠ免疫的兔抗血清与我国15群17型问号钩体参考标准株、2群2型双曲钩体国际标准株进行了显微镜凝集试验(MAT) ,发现该抗血清能…     

非肝炎口腔科患者血清及唾液中HGV 和TTV感染率的调查

目的 检测杭州地区非肝炎口腔科患者血清和唾液标本中庚型肝炎病毒（HGV）和输血传播病毒（TTV）感染率，进一步了解HGV和TTV传播途径和感染的高危人群。方法 分别从上述患者血液和唾液标本中提取RNA和DNA，采用逆转录-套式聚合酶链反应（RT-Nested PCR）和半套式聚合酶链反应（Hemi-nested PCR)分别检测HGV5′-NCR RNA和TTV N22区DNA，部分DNA，部分HGV和TTV扩增产物克隆后进行核苷酸序列测定。结果 226例血清标本中，仅HGV阳性27例（11.9%）、仅TTV阳性21例（9.3%）、HGV和TTV均阳性7例（3.1%）；226例唾液标本中，仅HGV阳性10例（4.4%）、仅TTV阳性9例（3.9%）、HGV和TTV均阳性2例（0.9%）；未见血清标本HGV和/或TTV检测结果阴性而唾液标本阳性者。2例患者血清标本及唾液标本HGV和TTV均阳性的扩增产物分别与报道的HGV和TTV核苷酸序列比较，同源性为88.65%～91.49%和65.32%～66.67%，但各自的血清标本与唾液标本HGV和TTV扩增产物同源性分别高达98.58%～99.29%和98.65%～98.20%。结论 杭州地区非肝炎口腔科患者HGV或TTV感染率均较高，其中部分携带病毒的患者唾液中均可检出HGV或TTV，提示HGV或TTV可能存在唾液传播途径，口腔科医师则是HGV或TTV感染的高危人群。     

问号钩端螺旋体磷脂酶C的活性及其内化时细胞内游离Ca2+水平的变化

目的:了解不同毒力的钩端螺旋体(简称钩体)对细胞内游离Ca2 水平的影响及其磷脂酶C(PLC)活性与细胞内游离Ca2 水平的关系.方法:建立问号钩体Vero和J774A.1细胞感染模型.采用fluo-3/AM胞内Ca2 特异荧光标记激光共聚焦技术,检测强毒力的问号钩体黄疸出血群赖型56601株和弱毒力的波摩那群波摩那型56608株及无毒力的双曲钩体Patoc Ⅰ株作用的Vero和J774A.1细胞胞内游离Ca2 水平.以[3H]PIP2为底物,采用同位素法检测上述3株钩体培养物上清、胞浆和胞膜中PLC的活性.结果:正常Vero和J774A.1细胞胞内游离Ca2 基础值分别为(102.3±8.2)%和(105.9±7.3)%,在观察时间内Patoc Ⅰ株钩体作用细胞的荧光强度变化百分数一直波动于(102.3±8.2)%～(102.2±8.3)%.问号钩体56601株感染的Vero和J774A.1细胞胞内游离Ca2 浓度呈双峰型增高,第一峰荧光强度变化百分数分别为(430.5±35.7)%和(747.5±18.5)%,第二峰荧光强度变化百分数分别为(380.6±17.4)%和(804.6±22.4)%.问号钩体56608株感染Vero和J774A.1细胞,其胞内游离Ca2 浓度均呈缓慢的单一坡型升高,其最大荧光强度变化百分数分别为(235.0±19.3)%和(402.4±17.4)%,明显小于56601株问号钩体(P<0.01).问号钩体56601株和56608株及双曲钩体Patoc Ⅰ株的培养物上清、胞浆蛋白和胞膜蛋白成分中均显示PLC活性(P<0.05).结论:不同毒力的问号钩体所感染细胞的胞内游离Ca2 水平及其峰型有明显差异,而且与被感染细胞的种类有关,与PLC活性无关.     

rLTB/rCTB-rOmpL1/1融合基因及其原核表达系统的构建和鉴定

目的:构建ltB/ctB-ompL1/1融合基因及其原核表达系统,鉴定表达产物的免疫和佐剂活性,检测问号钩端螺旋体(简称钩体)野生株ompL1基因的携带和表达情况及钩体患者血清特异性抗体水平.方法:采用连接引物PCR构建ltB-ompL1/1和ctB-ompL1/1融合基因,常规方法构建其原核表达系统.采用SDS-PAGE、Western blot和GM1-ELISA分别检测目的重组蛋白rLTB-rOmpL1/1和rCTB-rOmpL1/1表达量、免疫反应性及与GM1结合的活性.采用PCR和MAT分别检测97株问号钩体野生株ompL1基因及其表达情况.采用ELISA检测228例钩体患者血清ompL1基因产物的抗体.结果:与报道的相关序列比较,ltB-ompL1/1和ctB-ompL1/1融合基因核苷酸和氨基酸序列相似性,分别为99.7%～99.9%和99.5%～100%.rLTB-rOmpL1/1和rCTB-rOmpL1/1表达产量均约为细菌总蛋白的10%,主要以包涵体形式存在.rLTB-rOmpL1/1和rCTB-rOmpL1/1均分别能与rOmpL1/1兔抗血清和牛GM1结合.89.7%问号钩体野生株含有ompL1基因,87.6%问号钩体野生株分别与rOmpL1/1和rOmpL1/2兔抗血清出现效价,为1:4～1:256的MAT阳性结果.86.8%和88.6%的患者血清标本rOmpL1/1和rOmpL1/2抗体阳性.结论:rLTB-rOmpL1/1和rCTB-rOmpL1/1融合蛋白有良好的免疫原性及与GM1结合的活性.不同问号钩体血清群中广泛存在ompL1基因并高频率表达,不同基因型表达产物有广泛的交叉抗原性.     

问号钩端螺旋体属特异性外膜蛋白OmpL1和LipL21抗原表位预测及鉴定

目的 筛选问号钩端螺旋体(简称钩体)属特异性外膜蛋白OmpL1和LipL21有效T和B细胞联合抗原表位,为研制多抗原肽(multiple antigenic peptide,MAP)疫苗提供基础.方法 采用生物信息学方法预测OmpL1和LipL21分子中T和B细胞联合抗原表位.采用PCR扩增候选联合抗原表位片段并分别构建其噬菌体展示系统.分别以rOmpL1或rLipL21、黄疸出血群赖株、钩体患者抗血清为一抗,采用Western blot检测各抗血清与目的表位的免疫反应性及其强度.结果 通过抗原表位预测,选择了高分值的4个OmpLl和2个LipL21联合表位.经扩增获得了预期的各抗原表位片段,各目的表位序列均准确插入噬菌体PⅢ蛋白N端并有效表达.各抗血清均能识别上述6个联合表位.其中LipL21的97～112和176-184表位对任一抗血清均显示相似强度的杂交条带.综合4个OmpL1表位对3种抗血清的不同Western blot结果及其实际意义,杂交信号从强到弱依次为173～191、87～98、297～320和59～78表位.结论 所研究的6个联合表位均分别为LipL21和OmpL1的有效抗原表位,其中LipL21的97～112、176～184和OmpL1的87～98、173～191表位可应用于钩体MAP疫苗研制.     

杭州地区健康献血员输血传播病毒的检测及部分阳性标本的核苷酸序列分析

目的：了解杭州地区健康献血员中输血传播病毒（TTV）的感染情况和病毒基因组片段的变异性。方法：用酚－氯仿法从献血员的血清标本中提取DNA，半套式聚合聚合链反应检测TTV，部分阳性标本的扩增片段T－1克隆后测序。结果：203例献血员血清标本中TTV DNA的阳性率为15．3％，部分阳性标本扩增产物与报道的TTV TA278株的核苷酸和氨基酸序列比较，其同源性分别为63．51％－67．12％和59．46％－66．22％，结论：杭州地区献血员中TTV的携带率比较高。献血员感染的TTV可能是一种新的基因型。     

不同毒力钩端螺旋体属特异性外膜蛋白抗原的分析

目的　了解不同毒力钩端螺旋体株有无属特异性外膜蛋白抗原。方法　TR/ patocⅠ钩体属特异性抗原免疫家兔获得抗血清 ,以显微镜凝集试验检测TR/patocⅠ属特异性抗原抗血清对我国 15群 17型问号钩体和 2群 2型双曲钩体的凝集情况。采用Auran介绍的方法制备问号钩体黄疸出血群赖型 5 6 6 0 1株、波摩那群波摩那型 5 6 6 0 8株和双曲钩体三宝垄群Patoc型patocⅠ株的外膜蛋白 ,用SDS -PAGE及Westernblot分析不同毒力钩体外膜蛋白的电泳特征及与TR/ patocⅠ属特异性抗血清的反应性。结果　钩体TR/ patocI属特异性抗血清能与上述各株钩体发生凝集反应 ,其效价为 1∶2 5 6～ 1∶5 12。三种不同毒力钩体外膜蛋白有相似的SDS -PAGE图谱 ,其主要蛋白组分的分子量约为 6 0kDa ,Westernblot结果证实在约31kDa处有一共同的能与TR/patocI属特异性抗血清发生反应的阳性条带。结论　钩体细胞表面具有属特异性抗原 ,分子量31KDa外膜蛋白可能是属特异性抗原之一。     

问号钩端螺旋体诱导的Vero和J774A.1细胞的凋亡和超微结构病变

目的:探讨不同毒力的钩体黏附和侵入宿主细胞能力及其病理变化.方法:建立Fontana镀银染色法用于观察问号钩体黄疸出血群赖型56601株、波摩那群波摩那型56608株和双曲钩体三堡隆群patoc型Patoc Ⅰ株黏附Vero和J774A.1细胞的能力;采用电镜技术观察感染细胞的超微结构病变;采用FITC-Annexin V/PI荧光标记流式细胞术,检测紫外线灭活前后的上述钩体菌株诱导Vero和J774A.1细胞凋亡或坏死的情况.结果:问号钩体56601和56608株对Vero细胞的黏附率分别为24.2%和22.9%(P＞0.05);对J774A.1细胞的黏附率分别为49.0%和46.9%(P＞0.05);双曲钩体Patoc Ⅰ株不能黏附细胞.两株问号钩体侵入细胞后形成含有钩体的特殊吞噬泡,并引起相似的细胞超微结构病变,如细胞核染色质浓缩或溶解、细胞空泡变性、线粒体肿胀及线粒体嵴消失、内质网肿胀和膜旁核糖体消失等.灭活前的56601和56608株引起的Vero细胞凋亡率分别为84.4%和82.8%,灭活后则分别为77.9%和86.1%.灭活前后的56601株均以诱导Vero细胞晚期凋亡为主,其凋亡率分别68.0%和52.9%.灭活前后的56608株均以诱导Vero细胞早期凋亡为主,其凋亡率分别为64.1%和50.1%.在J774A.1细胞中,紫外线灭活前后的56601和56608株主要引起细胞坏死,其次是细胞凋亡,均以晚期凋亡为主.结论:所建立的Fontana镀银染色法可用于观察问号钩体的细胞黏附.问号钩体以内吞方式侵入细胞,并导致细胞超微结构病变.问号钩体诱导细胞坏死或凋亡可因细胞种类不同而异,与其毒力无明显关系.