RXR激动剂通过抑制PKC激活对抗高糖诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖

 目的:探讨视黄醇类X受体 (RXR)激动剂对高糖诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞(RASMCs)增殖的影响及其作用机制。方法:体外组织块干涸法培养RASMCs,以25 mmol/L葡萄糖干预,模拟糖尿病患者体内环境,通过WST-1法检测细胞增殖活性,BrdU插入法测定细胞DNA合成,流式细胞术检测细胞周期进程。用免疫印迹杂交方法检测细胞周期蛋白依赖激酶2(CDK2)、细胞周期蛋白依赖激酶抑制物p27Kip1的蛋白表达及蛋白激酶C (PKC)的磷酸化水平。结果:(1) 在高糖环境(葡萄糖终浓度为25 mmol/L)下,RASMCs的增殖活性、DNA合成速率及其在细胞周期S期的分布比例均显著增加;(2) 高糖显著增加RASMCs内CDK2蛋白的表达,但明显降低p27Kip1的蛋白表达水平;(3) RXR天然配体9-顺式维甲酸(9-cis-RA)可显著抑制高糖诱导的RASMCs增殖活性增强、DNA合成加速及RASMCs在细胞周期S期分布比例的增加幅度,且具有浓度依赖性;10-7mol/L浓度的SR11237(RXR特异性配体)与等浓度的9-cis-RA具有相似的抑制效应;(4) 9-cis-RA 和SR11237均可显著抑制高糖诱导的CDK2蛋白表达水平的增加幅度,同时上调高糖环境下p27Kip1蛋白的表达;(5) PKC抑制剂(PKC inhibitor peptide, 20 μmol/L)显著抑制高糖环境下RASMCs的增殖活性和CDK2蛋白的表达,但明显增加高糖条件下p27Kip1蛋白的表达;(6) 9-cis-RA 和SR11237可抑制高糖诱导的PKC蛋白磷酸化。结论: PKC的活化参与了高糖诱导下RASMCs的增殖过程。RXR激动剂通过抑制PKC活化对抗高糖诱导的血管平滑肌细胞增殖。     

阿托伐他汀通过抑制PKC的激活对抗高糖诱导的人脐静脉内皮细胞氧化应激反应

目的:探讨阿托伐他汀对高糖诱导的人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)产生氧化应激的影响及其作用机制。方法:体外培养HUVECs,以25 mmol/L葡萄糖干预,模拟糖尿病患者体内环境,通过流式细胞术和共聚焦显微镜检测细胞内的活性氧(ROS)水平,采用Lucigenin分析方法测定还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶活性,分别应用实时荧光定量PCR和免疫印迹杂交的方法检测 NADPH氧化酶亚基Nox4和Nox2/gp91^phox的表达水平,用免疫印迹杂交方法检测蛋白激酶C(PKC)蛋白的磷酸化水平。结果:(1)在高糖环境(终浓度为25 mmol/L)下,HUVECs内ROS生成显著增加,NADPH氧化酶的活性显著增强,NADPH 氧化酶Nox4和Nox2/gp91^phox亚基的mRNA和蛋白表达水平显著上调;(2)阿托伐他汀可显著抑制高糖诱导的ROS 生成、NADPH氧化酶活性的增强及NADPH 氧化酶Nox4和Nox2/gp91^phox亚基表达水平的增加幅度,且具有浓度依赖性;(3)PKC抑制剂(PKC inhibitor peptide, 20 μmol/L)可显著抑制高糖环境下ROS的生成、NADPH氧化酶活性的增强及NADPH 氧化酶Nox4和Nox2/gp91^phox亚基表达水平的增加幅度;(4)阿托伐他汀可抑制高糖诱导的PKC蛋白的磷酸化。结论:PKC的活化参与了高糖诱导的HUVECs产生的氧化应激反应。阿托伐他汀通过抑制PKC蛋白的活化对抗高糖诱导的内皮细胞产生的氧化应激反应。     

阿托伐他汀通过RXRα介导的抗氧化应激效应抑制高脂喂养糖尿病ApoE~(-/-)小鼠动脉粥样硬化的形成

目的:观察阿托伐他汀(Atorv)对链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病高脂喂养载脂蛋白E敲除(apolipoprotein E knockout,ApoE-/-)小鼠动脉粥样硬化的影响,探讨阿托伐他汀在糖尿病合并高脂饮食条件下对抗动脉粥样硬化的机制。方法:C57小鼠8只作为对照,34只高脂喂养的ApoE-/-小鼠随机分为3组:ApoE-/-组、STZ-ApoE-/-组和STZ-ApoE-/-+Atorv组。STZ腹腔注射建立糖尿病动物模型,测定小鼠空腹血糖、血脂水平,HE染色图像分析测定胸主动脉斑块面积;免疫杂交检测主动脉及细胞内NADPH氧化酶亚基gp91phox蛋白水平;Fenton反应Griess显色法测定血清及胸主动脉匀浆上清液活性氧(ROS)水平。I型胶原酶消化法培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),流式细胞术检测内皮细胞内ROS的水平,光泽精分析法测定NADPH氧化酶活性。采用干扰RNA和质粒转染的方法评价类视黄醇X受体α(RXRα)在Atorv抑制氧化应激中的作用。结果:(1)与C57组相比,ApoE-/-组小鼠胸主动脉斑块面积显著增加[(215.88±34.19)μm2vs 0μm2,P0.01],2组间空腹血糖水平无显著差异,血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、血清及胸主动脉ROS、胸主动脉gp91phox表达水平显著缩小(P0.05);(2)与ApoE-/-组相比,STZ-ApoE-/-组胸主动脉斑块面积进一步增加[(314.13±35.72)μm2vs(215.88±34.19)μm2,P0.05],血糖水平升高,血清TC、LDL-C、血清及胸主动脉ROS、胸主动脉gp91phox水平进一步增加(P0.05);(3)与STZ-ApoE-/-组相比,STZ-ApoE-/-+Atorv组胸主动脉粥样斑块面积显著降低[(217.47±24.56)μm2vs(314.13±35.72)μm2,P0.05],血糖、血清TG、HDL、TC、和LDL-C无显著变化,血清及胸主动脉ROS、胸主动脉gp91phox水平亦显著降低(P0.05);(4)高糖(25 mmol/L)干预后,HUVECs内ROS含量、gp91phox蛋白水平及NADPH氧化酶活性明显增加(P0.05),阿托伐他汀(10-8~10-6mol/L)显著降低高糖环境下HUVECs胞内ROS含量、gp91phox表达及NADPH氧化酶活性,且具有浓度依赖性;(5)将RXRαsiRNA转染至HUVECs之后,阿托伐他汀(10-6mol/L)对高糖环境下ROS生成及NADPH氧化酶活性的抑制效应显著减弱,RXRα质粒转染使RXRα过表达后,阿托伐他汀(10-6mol/L)抑制ROS生成及NADPH氧化酶活性的作用明显增强(P0.05)。结论:阿托伐他汀通过抑制高糖环境下机体的氧化应激反应对抗动脉粥样硬化;核受体RXRα介导阿托伐他汀的抗氧化应激效应。     

视黄醇X受体激动剂通过调控Smad2通路抑制TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞胶原合成

目的:探讨视黄醇X受体(RXR)激动剂9-顺式视黄酸(9-cis-RA)干预对缺氧条件下转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的大鼠心肌成纤维细胞(CFs)胶原合成的影响和分子机制。方法:心肌组织块干涸法培养大鼠CFs,持续通氮气法建立细胞缺氧环境,评价9-cis-RA和TGF-β1对CFs胶原合成的影响;ELISA法测CFs上清液Ⅰ、Ⅲ型胶原水平,Western blot法检测胞浆、胞核和细胞的Smad2及p-Smad2水平,细胞免疫化学法观察p-Smad2的亚细胞定位。结果:TGF-β1(0.01~10μg/L)在缺氧条件下呈浓度依赖性地诱导CFs合成Ⅰ型和Ⅲ胶原,当浓度达到5μg/L时,Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成水平显著增高(P0.01)。9-cis-RA(10-9~10-6mol/L)则呈浓度依赖性抑制TGF-β1在缺氧条件下诱导的CFs胶原合成,当浓度为10-7mol/L时,Ⅰ型和Ⅲ型胶原的合成水平显著降低(P0.01)。Smad2抑制剂(20 nmol/L)亦可显著抑制TGF-β1在缺氧条件下诱导的CFs Ⅰ型和Ⅲ型胶原的合成。免疫杂交和细胞免疫化学结果显示,与TGF-β1干预相比,TGF-β1和9-cis-RA联合干预组的CFs其胞浆内p-Smad2的水平显著增加,但胞核内p-Smad2的水平明显降低(P0.05)。结论:RXR激动剂9-cis-RA显著下调TGF-β1在缺氧条件下诱导的CFs Ⅰ型和Ⅲ型胶原的合成,其机制与其抑制TGF-β1诱导的p-Smad2细胞核转位有关。