MXA蛋白抑制HBV复制的体外研究

目的研究MXA蛋白抑制HBV复制的活性。方法将pcDNA3．1-MXA重组质粒和PU19-1．24HBV重组质粒分别按1：1、2：1共转染HepG2细胞（MXA组），对照组使用空pcDNA3．1、Salon DNA和PU19-1．24HBV重组质粒共转染，3d后Western blot检测MXA蛋白表达，Abbott法检测细胞上清HBeAg和HBsAg分泌量，定量PCR检测上清和胞内HBV DNA水平，统计学分析结果。pcDNA3．1-MXA与PU19-1．24HBV重组质粒共转染HepG2细胞，对照组为pcDNA3．1-MXA重组质粒、PU19空质粒和Salon DNA共转染．3d后裂解细胞Western blot检测MXA蛋白表达。结果Western blot显示MXA组有MXA蛋白表达：与对照组相比，pcDNA3．1-MXA和PU19—1．24HBV重组质粒按1：1转染时，MXA组HBeAg下降27％．上清HBV DNA和细胞内HBV DNA分别下降1个log值和0．6个log值；按2：1比例转染时MXA组HBeAg较对照组下降66％，上清HBV DNA和细胞内HBV DNA水平分别下降1．9个和1．7个log值，差异均具有统计学意义（P〈0．05）。Western blot检测显示MXA蛋白抑制HBV组与对照组MXA蛋白表达没有明显差别。结论MXA蛋白在HepG2细胞具有抑制HBV复制活性，抑制活性与蛋白的表达量相关；在抑制HBV复制过程中MXA蛋白自身可能不发生降解。     

HBV 基因T1862突变真核表达载体的构建及在Cos7细胞中的表达

目的研究HBV T1862变异的生物学意义。方法采用分子生物学方法,构建HBV前C/C基因EB病毒真核表达载体,利用体外定点突变技术诱导前C/C基因T1862变异,经PCR-RFLP初筛并经测序终鉴定出阳性克隆后,以脂质体介导方法将突变前后的重组质粒转染Cos7细胞, 以ELISA 检测HBeAg的表达量。结果未突变的重组质粒可稳定表达HBeAg,突变后的重组质粒未能检测到HBeAg表达。结论 HBV前C/C基因1862点突变的真核表达载体的构建,为体外研究该点突变引起HBV的一系列生物学改变奠定基础。     

阿德福韦耐药乙型肝炎病毒株的快速检测和动态观察

目的设计PCR联合限制性片段长度多态性（PCR—RFLP）快速检测HBV阿德福韦耐药变异（rtN236T）的方法以及观察阿德福韦耐药毒株的动态变化情况。方法7例乙型肝炎患者在阿德福韦单药治疗过程中出现病毒突破或应答不完全。对其系列血清标本的HBVDNA逆转录酶部分区域进行直接或克隆后测序，设计和应用PCR—RFLP方法对rt236位点的变异情况进行检测。采用Hamming距离法计算HBV部分逆转录酶区域的基因多样性。结果l例患者出现rtA18IV变异，3例为rtN236T变异。建立了基于限制性内切酶DraI或HpaI的PCR—RFLP方法检测rtN236T变异：可以检测至少10％的弱势毒株，特异性为100％。在病毒突破前8个月可以检测到耐药毒株；该耐药毒株后来成为优势毒株。1例患者停用阿德福韦3个月后野生毒株取代耐药毒株重新成为优势株。1例患者在病毒突破后继续服用阿德福韦，rtN236T突变被一个新的突变株（rtN236V）替代。拉米夫定耐药患者的HBV逆转录酶有更明显的基因多样性。结论建立了PCR—RFLP快速检测rtN236T变异的方法；阿德福韦耐药毒株可以表现为不同的转化过程。     

慢性无症状乙型肝炎病毒携带者外周血T细胞受体谱型分析

目的 分析慢性无症状乙型肝炎病毒携带者（AsC）外周血T细胞TCR-β链CDR3谱型的变化,了解AsC患者T淋巴细胞克隆性增生情况。方法 利用逆转录聚合酶链反应扩增T细胞受体（TCR）各BV家族CDR3区基因,利用谱型分析技术比较各家族CDR3长度分布,了解AsC T淋巴细胞克隆性增生情况。对单克隆或寡克隆性增生家族的PCR产物进行序列测定和氨基酸序列分析,进一步了解克隆增生T淋巴细胞的均一性。结果 4名正常人的TCR CDR3谱型均呈现正态分布,而9例AsC中均存在不同BV家族的T细胞克隆性增生,CDR3区直接测序结果证实增生的T细胞克隆具有不同长度和序列的氨基酸序列。结论AsC外周血T淋巴细胞存在克隆性增生,且增生的T淋巴细胞不具有均一性。     

拉米夫定耐药毒株的P基因序列特点

目的探讨拉米夫定耐药毒株P基因序列特点。方法分析247例慢性乙型肝炎患者血清标本,利用PCR-RFLP筛检YMDD变异株,对YMDD变异阳性的部分患者标本进行P基因测序。结果应用PCR-RFLP筛检发现了42例感染YMDD变异株的患者,对其中的19例患者进行测序分析有10例除发生YMDD变异外还有P基因A-E区其他部位氨基酸的突变,有4种点突变同时在2个以上的患者中发生,包括rtL80I,rtG172E,rtG174C和rtG172E/rtG174C联合突变。结论拉米夫定耐药毒株除了常见的C区YMDD变异和B区rtL180M变异之外,还可以发生其他位点的突变,但这些位点的突变是否与拉米夫定耐药有直接关系还有待进一步证实。     

KiSS-1和E钙黏蛋白在贲门癌组织中的表达及临床意义

目的检测KiSS-1及上皮细胞E钙黏蛋白（E—cadherin）在贲门癌组织中的表达，探讨其临床意义及两者的相关性。方法采用免疫组织化学方法检测80例贲门癌、20例正常贲门组织中KiSS-1及E钙黏蛋白的表达情况。分析其与相关临床病理参数的关系以及两者表达的相关性。结果KiSS-1的表达与贲门癌的临床分期、淋巴结转移呈负相关（均P〈0．05），与分化程度无相关性（均P〉0．05）；E钙黏蛋白的表达与贲门癌的临床分期、淋巴结转移、分化程度均呈负相关（均P〈0．05）。Spearman等级相关分析显示，KiSS-1与E钙黏蛋白在贲门癌中的表达呈正相关（rs=0．722，P〈0．05）。结论KiSS-1与E钙黏蛋白可能在抑制贲门癌的侵袭和转移过程中起重要作用。     

中国华南地区慢性乙型肝炎患者HLA-A等位基因分布的初步调查及其意义

目的 了解中国华南地区慢性乙型肝炎(CHB)患者HLA-A11、A2、A24、A33等位基因的分布状况,并为筛选HBV特异性CTL新表位提供必要背景资料.方法 以267例CHB患者和300例健康献血员为研究对象,提取其外周血染色体基因组DNA,用PCR-SSP法进行HLA-A11、A2、A24、A33等位基因检测型,并进行统计学比较.结果 CHB组HLA-A11、A2、A24、A33的基因频率分别为57%、41%、21%、7%,以HLA-A11最常见,较HLA-A2的基因频率高16%.健康对照组四种HLA-A等位基因的频率分别为57%、46%、24%、14%,HLA-A11较HLA-A2的频率高¨%.HLA-A33的频率在两组间有显著差异(x2=7.556,P=0.006).CHB组HLA-A2/A11、A2/A24、A2/A33、A11/A24、A11/A33、A24/A33的基因频率分别为17%、4%、1%、16%、4%、0.4%,健康人群则为18%、8%、4%、11%、5%、1%,各种基因组合的出现率在两组间近似.HBeAg( )与HBeAg(-)CHB组比较,HLA-A11(x2=3.324,P=0.072)、A2(x2=0.324,P=0.569)、A24(x2=0.308,P=0.579)、A33(x2=1.159,P=0.282)等位基因的频率分布在两组间无显著性差异.结论 中国华南地区CHB患者和健康人群的主要HLA-A等位基因均为HLA-A11、A2、A24及A33,以HLA-A11最为多见,提示鉴定HLA-A11限制性HBV特异性CTL新表位具有十分重要的意义;此四种等位基因及其组合模式与CHB患者的HBeAg状态无明显相关,但与HBV感染的其他临床特点及抗病毒治疗应答之间的关系有待研究.     

乙型肝炎病毒拉米夫定耐药株的重组逆转录病毒载体及其包装细胞系的建立

目的构建1.3拷贝乙型肝炎病毒(HBV)拉米夫定耐药株的重组逆转录病毒载体及其包装细胞系。方法在野毒株1.3拷贝HBV载体的基础上采用定点突变的方法将rtL180M,rtM204V位点突变,构建拉米夫定耐药病毒株,并通过PCR、限制性内切酶酶切,分别以正向和反向将野毒株和耐药株分别连接于逆转录病毒载体pLNCX2的相应酶切位点,构建成重组逆转录病毒载体,经双酶切及PCR扩增鉴定。重组载体转染包装细胞,筛选培养细胞克隆并进行病毒滴定。结果通过双酶切、PCR扩增、测序鉴定证实成功构建了1.3拷贝HBV拉米夫定耐药株的逆转录病毒载体。成功建立包装细胞系并测得病毒滴度均为1×105cuf/ml。结论含正向及反向1.3拷贝HBV拉米夫定耐药的重组逆转录病毒载体及其包装细胞系构建成功,可以用于拉米夫定耐药细胞模型研究。     

肝门部胆管癌的手术治疗(附45例报告)

目的总结45例肝门部胆管癌的治疗。方法对1995年7月～2005年7月行手术治疗的45例肝门胆管癌患者的临床资料进行回顾性分析。结果手术切除13例（28．9％），平均存活21个月；单纯引流28例（62．2％），平均存活8个月；探查活检4例（8．89％），平均存活2个月；无手术死亡。结论肝门部胆管癌的治疗以手术切除为主，应做到早期诊断和根治性切除。对于不能切除病例，应设法减轻黄疸。