稳定过表达生长分化因子５基因大鼠脂肪干细胞系的建立

目的:探讨慢病毒介导的稳定过表达生长分化因子5(GDF-5)基因大鼠脂肪干细胞(ASCs)的构建条件和方法。方法:取大鼠腹股沟脂肪垫组织,采用Ⅰ型胶原酶消化贴壁法分离培养大鼠ASCs。倒置相差显微镜观察细胞形态,CCK-8法测定细胞生长曲线,流式细胞仪鉴定细胞表型。制备带GDF-5/GFP融合基因的慢病毒载体系统,探索不同感染复数(MOI=1、5、10、20、40、60、80、100)的转染效率,选择最佳MOI,采用流式细胞仪检测转染效率。对转染细胞行流式细胞筛选,测定筛选后转染细胞的阳性率。筛选出的细胞行细胞爬片,DAPI染色,形态学上进一步验证细胞阳性率;并采用CCK-8法检测转染后细胞活力。结果:成功培养大鼠ASCs,流式细胞免疫表型鉴定:间充质干细胞表面抗原(CD90、CD29、CD44、CD105)表达阳性,造血细胞表面抗原(CD45、CD34)和骨髓干细胞表面抗原(CD106)表达阴性。成功构建GDF-5过表达慢病毒载体系统,慢病毒转染大鼠ASCs最佳MOI为40,转染率为65%。采用GFP荧光流式细胞筛选技术筛选后阳性率可提高至96%。CCK-8法显示,转染后细胞活力、生长曲线与未转染细胞无明显差异。结论:胶原酶消化法可成功培养大鼠ASCs,流式细胞筛选技术可显著提高转染细胞阳性率,且对细胞系活力无显著影响。     

血管内皮细胞联合同种异体神经移植修复长距离大鼠坐骨神经缺损

目的:探讨血管内皮细胞(EC)联合去细胞同种异体神经移植修复长距离大鼠坐骨神经缺损的效果。方法:80只雌性Sprague-Dawley大鼠,20只取双侧1.5cm长坐骨神经,Hudson优化法制备去细胞同种异体神经(ANA);60只均于右侧建立1.5cm长坐骨神经缺损模型,随机分为反转吻合坐骨神经的自体神经(ANG)移植组、ANA移植组及ANA+EC移植组(n=20)。术后1、2、4、12周,每组各取5只进行测试,指标包括:坐骨神经功能指数(SFI)、电生理检查[动作电位潜伏延迟率(LDR)、神经传导速度恢复率(NCVRR)和复合肌动作电位恢复率(CMAPRR)]、最大强直收缩力恢复率(MTFRR)、腓肠肌湿重恢复率(MWRR)、微血管增生率(MVDPR),术后12周甲苯胺蓝染色下测量神经纤维数量、髓鞘厚度、G ratio,并行电镜观察。结果:术后早期,ANA+EC移植组大鼠SFI、MVDPR较ANA移植组改善明显(P0.05);术后晚期,ANA+EC移植组大鼠CMAPRR、MTFRR、MWRR较ANA移植组恢复更佳(P0.05);术后12周时,ANA+EC移植组再生神经数量和形态更接近ANG移植组。结论:对于长距离坐骨神经缺损的大鼠模型,使用载血管内皮细胞的去细胞同种异体神经进行神经移植修复,早期肌肉功能优于单独使用去细胞同种异体神经,晚期神经纤维的数量和质量更接近于自体神经移植。     

硬膜外静脉曲张误诊为腰椎间盘突出症一例

患者女性,57岁,主因"腰痛伴右下肢放射痛5年,间歇性跛行2年"于2011年4月25日来我院就诊.患者经长期保守治疗,症状无明显改善.体检:腰椎活动受限,L4-5棘突旁压痛,右下肢直腿抬高试验60°,双下肢肌力、感觉、肌张力均未见明显异常.跟腱反射++,膝跳反射++.术前MRI示L4-5椎间盘髓核脱出,黄韧带肥厚,L4-5平面椎管狭窄(图1,2).CT检查示L4-5椎间盘向周围延伸,L5椎体后缘局部骨质受压吸收,硬膜囊受压(图3,4).初步诊断为L4-5椎间盘突出症伴椎管狭窄.患者于2011年5月2 日俯卧麻醉后.取L5为中心切开皮肤长约4 cm,剥离双侧椎旁肌,C臂机定位于两侧L4-5椎间开窗,见侧隐窝狭窄,扩大减压后,松解神经根,探查L4-5椎体后壁,未见影像学上的脱出髓核组织.     

细胞自噬对饥饿环境下椎间盘髓核细胞的保护作用

目的: 探讨饥饿条件下椎间盘髓核细胞是否发生自噬及自噬对髓核细胞的作用。方法: 原代培养SD大鼠髓核细胞,对细胞表型进行鉴定后,将细胞分为正常对照组、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)加DMEM培养基组、3-MA加EBSS培养基组和EBSS饥饿组,接着用单丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverine,MDC)染色、透射电镜和Western blotting观察各组细胞的自噬差异,最后采用CCK-8法测定细胞生长抑制率以及TUNEL法测定细胞凋亡率。结果: 成功培养出SD大鼠髓核细胞。与对照组相比,电镜和荧光显微镜下观察到EBSS培养基诱导的髓核细胞出现自噬囊泡,但是3-MA 抑制后细胞自噬泡明显减少;Western blotting检测发现LC3-II/LC3-I和Beclin-1/β-actin在EBSS处理组明显大于3-MA+EBSS处理组和对照组(P<0.05), 而3-MA+EBSS处理组的细胞抑制率和凋亡率明显高于EBSS处理组(P<0.05)。结论: 饥饿可以诱导大鼠椎间盘髓核细胞发生自噬,并且3-MA能抑制自噬发生。自噬对饥饿环境下的髓核细胞可能具有一定的保护作用。     

不同细胞来源外泌体在骨科退行性疾病中的研究进展

外泌体是一种由细胞分泌至胞外的膜性囊泡样微体。外泌体在以骨关节炎（osteoarthritis，OA）和椎间盘退变为主的骨科退行性疾病的诊疗中具有应用价值。包括间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）在内的多种细胞来源的外泌体具有抑制软骨细胞退化、促进再生等作用。其中研究最为广泛的是MSC来源外泌体，其优点在于细胞来源丰富、产量较高、易获得。而软骨细胞外泌体内的微小RNA（microRNA，miRNA）表达谱与其亲本细胞存在显著差异，提示其在软骨分化和维持内稳态也具有重要作用。正常髓核细胞来源外泌体可促进MSC迁移及向髓核细胞定向分化，炎症下的滑膜细胞外泌体还可成为加重软骨退变的因素。本文通过对不同细胞来源外泌体在骨科退行性疾病中的研究进行综述，为该类疾病的诊断和治疗带来新的思路。     

成纤维细胞生长因子2在椎间盘中表达与作用的研究进展

成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)目前发现总共有22种,但在椎间盘领域主要涉及的是成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2,FGF2)[1]。因为FGF2呈碱性,故亦称为碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)。FGF2是一种具有促有丝分裂作用的活性多肽分子,在体内具有广泛的作用。在椎间盘中最基本的病理变化是椎间盘退变     

酸环境对大鼠髓核细胞自噬及功能的影响

目的:观察酸环境下髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)中卵巢癌G蛋白偶联受体1(ovarian cancer G-protein-coupled receptor 1,OGR1)和自噬相关蛋白LC3的表达水平,探讨自噬激活机制,初步分析其对细胞功能的影响。方法:取SD大鼠正常髓核组织,分离培养NPCs,甲苯胺蓝、阿利新染色和Ⅱ型胶原免疫荧光检测鉴定NPCs。扩增培养NPCs,取第2代NPCs,在pH值为6.2、6.4、6.8、7.0、7.2和7.4的培养基中培养24h,免疫荧光观察NPCs中OGR1的表达情况,Western blotting检查细胞中OGR1和LC3-Ⅱ蛋白表达水平;在pH值为6.4的培养基中培养0、3h、6h、12h、24h、48h后,采用Western blotting检测NPCs中LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白表达水平。构建3个不同靶点的OGR1干扰序列,检测最合适滴度慢病毒,用最适滴度慢病毒转染NPCs,使用Western blotting和Real-time PCR检测不同干扰序列的沉默效果,选取最适干扰系列构建OGR1-shRNA慢病毒载体。取第2代NPCs,分为4组:正常组(DMEM培养基)、pH值6.4培养基组(空白组)、pH值6.4培养基空载体组(空载体组)、pH值6.4培养基OGR1-shRNA慢病毒转染组(转染组),培养24h后用Western blotting检测LC3-Ⅱ和p62蛋白表达水平;Alcian染色观察NPCs中蛋白多糖的表达情况。结果:(1)分离培养的细胞高表达蛋白多糖和Ⅱ型胶原,符合NPCs表型。(2)OGR1蛋白表达水平与培养基pH值相关,pH值7.0时,OGR1和LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著性升高(P0.05),pH值6.4时表达量最高。(3)在pH值6.4的培养基中培养时,细胞中LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表达量与培养时间有关,24h时达高峰,48h仍较高。(4)3个干扰序列对OGR1均有沉默作用,与对照组比较有显著性差异(P0.05),OGR1-shRNA1沉默效果最佳。(5)转染组细胞在pH值6.4的培养基中培养24h后,LC3-Ⅱ表达水平显著性低于空载体组(P0.05);p62表达水平显著性高于空载体组(P0.05);蛋白多糖的表达低于空载体组(P0.05)。结论:酸环境可促进大鼠NPCs中OGR1蛋白表达和自噬水平升高,OGR1介导了细胞自噬的激活,并影响NPCs的生物学功能。