乙型流感病毒单克隆抗体的制备与评价

目的制备抗乙型流感单克隆抗体,为建立特异、灵敏、简便的乙型流感病毒快速检测方法奠定基础。方法应用鸡胚接种法、ELISA方法、免疫扩散法、血凝抑制法筛选能稳定分泌抗乙型流感病毒单抗的杂交瘤细胞,并对分泌的单抗的安全性,有效性、抗体亚型,特异性及灵敏性进行了全面评价。结果获得了3株能稳定分泌抗乙型流感病毒单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为3G11、4F9、8G6;制备的抗乙型流感病毒单克隆抗体无鼠源病毒污染;抗体亚型为IgG2a亚型,轻链均为κ链;对乙型流感病毒具有高度特异性,而与甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、呼吸道腺病毒等无交叉反应。结论制备的乙型流感病毒单克隆抗体具有特异性强、灵敏性高,为临床乙型流感的早期快速诊断及流行病调查奠定了实验基础。     

表达CTLA4抗体的重组流感病毒构建及溶瘤效果研究

目的拯救表达免疫检查点CTLA4抗体的重组流感病毒,全面鉴定并体内外实验评价其溶瘤效果。方法利用流感病毒反向遗传学(reverse genetics,RG)技术,以A/Puerto Rico/8/34(PR8)为载体,分别在PR8病毒PB1和PA基因片段插入免疫检查点CTLA4抗体的重链和轻链构建重组质粒pFlu-CTLA4-PB1、pFlu-CTLA4-PA,与PR8病毒的其余6个质粒pHW191-PB2、pHW194-HA、pHW195-NP、pHW196-NA、pHW197-M、pHW198-NS共转染COS-Ⅰ和MDCK细胞,经拯救、筛选、鉴定获得重组溶瘤流感病毒,命名为rFlu-muCTLA4。通过血凝试验、EID_(50)、PCR等方法全面鉴定;ELISA测定anti-CTLA4抗体含量;3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulphophenyl)-2H-tetrazolium 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5(MTS)细胞活力测定重组病毒对小鼠肝癌H22细胞的杀伤效果;利用小鼠肝癌模型,评价重组病毒在体内对肿瘤的抑制效果。结果 rFlu-muCTLA4的血凝效价为2~9～2~(10),且能够在鸡胚中稳定传代;EID_(50)为10~(-8)EID_(50)/ml;重组病毒的PB1、PA片段与预期大小一致;重组病毒接种鸡胚培养2 d可检测到anti-CTLA4抗体,4天达到高峰值。MTS结果显示,rFlu-muCTLA4能特异性杀伤H22细胞活力,呈现剂量依赖性。动物实验表明,重组病毒能显著减小小鼠肝癌肿瘤体积,提高动物存活率并延长存活时间。结论表达免疫检查点CTLA4抗体的重组流感病毒rFlu-muCTLA4在体内外能靶向杀伤肝癌细胞,有望为溶瘤病毒靶向治疗肝癌提供新的思路。     

甲型H7N9流感裂解疫苗制备及免疫保护效果的评价

目的构建、拯救重配甲型H7N9流感病毒疫苗候选株并制备甲型H7N9流感裂解疫苗,动物实验评价甲型H7N9流感裂解疫苗的免疫原性及免疫保护性效果。方法采用反向遗传学技术将A/Anhui/1/2013(H7N9)疫苗株的HA、NA基因和A/Puerto Rico/8/34(PR8)毒株的PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因进行重配,转染细胞后筛选拯救甲型H7N9流感病毒疫苗候选株,制备rgPR8-H7N9流感裂解疫苗抗原。腹腔注射免疫Balb/c小鼠,检测血清IgG、IgG1、IgG2a、HI效价,进一步用野生株攻毒,评价rgPR8-H7N9流感裂解疫苗的免疫保护效果。结果成功拯救甲型H7N9流感病毒疫苗候选株rgPR8-H7N9。制备的重配甲型H7N9流感裂解疫苗对小鼠产生较高的HI抗体效价。IgG1/IgG2a亚型检测结果表明小鼠体内以诱导体液免疫为主。攻毒实验显示甲型H7N9流感裂解疫苗能够有效降低肺部的病毒载量,肺组织病变显著减轻、体质量下降后趋于稳定,疫苗剂量达到15μg即可全部存活。A/Anhui/1/2013(H7N9)野生株流感病毒攻毒,甲型H7N9流感裂解疫苗能够达到保护小鼠效果。结论成功拯救重配甲型H7N9流感病毒疫苗候选株rgPR8-H7N9,制备的甲型H7N9流感裂解疫苗具有较好的免疫原性及免疫保护性,为H7N9流感裂解疫苗的研发及进入临床研究提供了实验依据。     

两质粒系统重配甲型H1N1流感病毒株的研究

目的构建两质粒冷适应流感病毒拯救系统,提高流感病毒的重配效率。方法本研究通过构建克隆载体pfastbac△plh HTB,将流感病毒A/Ann Arbor/6/60(H2N2)6个内部基因(PB2、PB1、PA、NP、M、NS)的双向转录表达元件定向克隆入此载体,获得pfastbac△plh HTBP6。同时将流感病毒A/California/7/2009(H1N1)表面基因(HA、NA)双向转录表达元件定向克隆入p ENTR-1A质粒,获得p ENTR-1AP2。将2个重组质粒共转染MDCK/COSI细胞,细胞上清接种10日龄SPF鸡胚,收取尿囊液,血凝实验筛选阳性株,并进行全面鉴定。结果本研究利用两质粒系统成功重配甲型H1N1流感病毒株,命名为TRG A/California/07/2009(H1N1)Vca,重配病毒株传代后HA效价为2~8,形态符合流感病毒典型特征,大小80~120 nm,具有冷适应、温度敏感表型。结论两质粒流感病毒拯救系统为高效重配流感疫苗株提供了新策略。     

小鼠α烯醇化酶基因真核表达载体的构建与鉴定

目的构建小鼠α烯醇化酶（En01）基因的真核表达载体。方法以健康小鼠肾脏组织细胞的eDNA为模板,采用聚合酶链式反应（PCR）扩增Enol基因编码区的全部序列,克隆至真核细胞表达载体pCDNA3．1^＋中,测序鉴定目的基因用阳离子脂质体转染的方法转染中国仓鼠卵巢CHO细胞。结果PCR扩增的特异性片段长度为1304bp,以此构建重组质粒pCDNA3．1^＋-Enol,测序结果与Gen．bank中的鼠源Enol基因eDNA序列一致。转染中国仓鼠卵巢细胞后可检测到Enol蛋白的表达。结论构建的真核表达载体pCDNA3．1^＋-Enol可在真核细胞内正确表达,这为进一步的疫苗研究奠定了基础。     

胶体金免疫层析试纸条快速检测乙型流感病毒

目的建立有效、简便的胶体金免疫层析试纸条快速检测乙型流感病毒感染的方法。方法通过对乙型流感病毒核蛋白单克隆抗体进行胶体金标记,成功研制了乙型流感病毒免疫层析检测试纸条。结果该试纸条操作简单,肉眼于10～15 min内判定结果,对乙型流感病毒具有高度特异性,与甲型H1N1、H3N2亚型流感病毒等其他重要呼吸道病毒无交叉反应。试纸条在室温保存12个月、2～8℃保存18个月,其特异性和灵敏度无明显变化。对从内蒙自治区医院收集的流感样症状病人的702份鼻咽部分泌物进行检测,与美国Quidel公司同类产品的符合率为95%。结论建立的乙型流感病毒免疫层析检测方法具有简便、快速、特异、敏感和稳定等特点,对乙型流感病毒感染疾病的临床检测与早期诊断具有重要意义。     

减毒猪流感病毒与灭活猪流感病毒的体液免疫及细胞免疫效果的观察

摘要：目的 研究减毒A/California/07/2009ca流感病毒及A/California/07/2009灭活流感病毒之间的体液免疫及细胞免疫效果的差异。方法 蔗糖密度梯度离心纯化减毒A/California/07/2009ca流感病毒经滴鼻途径免疫BALB/c小鼠,以灭活病毒肌肉注射组为对照。应用ELISA的方法检测小鼠血清中IgG1、IgG2a及脾淋巴细胞上清液中的IL-6、IL-4和IFN-γ的效价。结果 通过对小鼠血清中IgG1、IgG2a及脾淋巴细胞上清液中的IL-6、IL-4及IFN-γ细胞因子的检测,结果显示,灭活流感病毒的IgG1/IgG2a高于减毒流感病毒,同时灭活病毒产生的IL-6和IL-4高于减毒病毒,但IFN-γ低于减毒病毒。结论 A/California/07/2009灭活病毒能够刺激小鼠机体产生较好的体液免疫,但细胞免疫较差,而减毒A/California/07/2009ca流感病毒能够较好激发小鼠体内的体液免疫和细胞免疫反应。通过这些数据我们可以初步断定,A/California/07/2009ca减毒病毒具有较全面的免疫效果,这为流感喷鼻疫苗的研制提供了理论数据参考。     

淋巴细胞体外杀伤小鼠神经母细胞瘤实验观察

【目的】建立体外小鼠神经母细胞瘤细胞和淋巴细胞共培养的细胞模型,通过检测不同免疫学指标来衡量淋巴细胞杀伤肿瘤细胞能力。【方法】从正常C57BL／6小鼠体内分离脾淋巴细胞,调节到适当的浓度,将神经母细胞瘤的细胞株（N2a）和新鲜分离的脾淋巴细胞共培养。在倒置显微镜下观察脾淋巴细胞形态,同时分离培养上清,用ELISA方法检测IL-6、IFN-r、TNF-α含量。MTT方法检测共培养体系中存活细胞状况,用来反映脾淋巴细胞体外杀伤神经母细胞瘤细胞的能力。【结果】体外共培养模型显示,脾淋巴细胞具有强大的杀伤N2a肿瘤细胞的能力,37℃5％C02培养48h后,在4—1×10^6／mL脾淋巴细胞浓度下无肿瘤细胞生长。细胞培养上清中可以检测到高浓度的IL-6（1849pg／mL）和中浓度的TNF-α（137pg／mL）,却检测不到IFN-r。【结论】脾淋巴细胞具有很强体外杀伤N2a肿瘤细胞能力,IL-6可能发挥着比TNF-α更重要作用,这为临床上神经母细胞瘤手术后的免疫治疗提供了新的思路。     

重组金黄色葡萄球菌肠毒素B蛋白可溶性微针制备及免疫效果研究

目的建立重组金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)蛋白的可溶性微针体外检测方法及体内免疫效果评价。方法通过动态光散射(DLS)检测蛋白粒径、BCA法检测单片微针的蛋白浓度、活体成像实验检测微针皮内注射后蛋白在体内的停留时间,通过DRIZE评分评价微针注射后的皮肤情况,通过动物实验评价重组SEB蛋白可溶性微针的免疫原性及免疫保护效果。结果DLS分析显示SEB蛋白可溶性微针负载的重组SEB蛋白粒径与重组SEB蛋白溶液中的SEB蛋白粒径无明显差别,单片微针中重组SEB蛋白含量为(13.2±1.4)μg,活体成像实验显示相对于肌肉注射,重组SEB蛋白可溶性微针皮内给药后荧光蛋白在体内的停留时间延长,动物实验显示13.0μg的重组SEB蛋白可溶性微针即能引发免疫反应,并且在2LD50SEB攻毒剂量下能够产生很好保护效果。结论重组SEB蛋白可溶性微针能够刺激小鼠机体产生较好的免疫原性及免疫保护效果,为发展疫苗新型免疫途径提供了新策略。