汉坦病毒核蛋白的重组表达及其免疫印迹法在肾综合征出血热血清抗体检测中的应用

目的 应用基因工程技术,在昆虫细胞中表达汉坦病毒（HV）S基因,表达产物作为诊断抗原,用于检测血清中抗HV特异性抗体IgG。方法 PCR扩增HV-Z10株N蛋白（NP）编码基因,基因工程方法构建NP编码基因昆虫表达系统 rBAC-Z10S-TN。间接荧光法了解重组NP（rNP）表达及与特异性免疫反应情况,SDS-PAGE观察重组蛋白表达情况。建立免疫印迹法检测肾综合征出血热（HFRS）患者血清样品,并与常规间接免疫荧光法进行比较。结果 rBAC-Z10S-TN高效表达rNP,SDS-PAGE显示rNP的蛋白表达带,此抗原仅与HFRS患者血清起反应。经双盲试验,两法检测血清143份,HFRS阳性符合率为97.67%。结论 成功构建了HV-Z10株NP编码基因高效真核表达系统。所建立的免疫印迹法可作为HFRS简便、安全、敏感、特异的血清学诊断新方法。     

一步法流行性乙型脑炎病毒TaqMan荧光定量反转录聚合酶链反应方法的建立及应用

目的 建立一种特异、灵敏、快速检测流行性乙型脑炎(乙脑)病毒的荧光定鼍RT-PCR方法.方法 根据GenBank登录的乙脑病毒毒株序列,应用生物软件在乙脑病毒基因的保守区设计与筛选引物和探针,对荧光定量RT-PCR反应体系与条件进行优化,验证方法的特异性、敏感性和重复性.并通过对蚊虫样本的检测,以评价该方法的实际应用价值.结果 优化结果表明荧光定量RT-PCR的最佳反应体系为0.1 μmol/L探针浓度,0.2μmol/L引物浓度,5 mmol/L Mg2+浓度.结果 表明该方法对乙脑病毒的检测有高度的特异性、通用性,对1～4型登革热病毒、狂犬病毒、汉坦病毒(SEO型与HTN型)均无交叉反应,检测的灵敏度达0.1 TCID50,重复性分析表明同一样品Gt值的重复检测4次,其标准差均在合理范围内,分别为0.033、0.079、0.149和0.411.对110批蚊虫标本进行荧光定量RT-PCR检测和病毒分离榆测,结果荧光定量RT-PCR检测出7份阳性,而病毒分离则只检测出3份阳性,表明建立的荧光定量RT-PCR方法更敏感,可直接从蚊虫样本中检测乙脑病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右,且操作简便、敏感性高.结论 研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR的方法具有特异、敏感、快速的特点,适用于乙脑病原学的快速检测.     

浙江省龙游县鼠形动物中5种病原的自然感染情况调查

  目的  了解浙江省衢州市龙游县鼠形动物中5种病原的自然感染情况,为预防和控制相关疾病提供依据。  方法  在龙游县野外捕获鼠形动物,解剖获取肺和肝脏组织。 对鼠肺进行冷冻切片,用冷丙酮固定切片后用直接免疫荧光法检测汉坦病毒的携带情况;提取鼠肝DNA,利用特异性引物进行PCR扩增,检测伯氏螺旋体、查菲埃立克体、无形体、鼠疫耶尔森菌。  结果  2017年捕获的黑线姬鼠、针毛鼠、社鼠、臭鼩鼱、黄胸鼠和褐家鼠（共6种88只）中,黑线姬鼠为优势鼠种（88.64%）,其次为针毛鼠（5.00%）,其他种数量很少。 2019年捕获的黑线姬鼠、黄胸鼠、针毛鼠、褐家鼠、臭鼩鼱和巢鼠中（共6种103只）,黑线姬鼠也为优势鼠种（84.47%）。 病原检测结果发现,在2017、2019年捕获的黑线姬鼠中,汉坦病毒抗原的阳性率分别为3.85%和4.60%,伯氏螺旋体核酸阳性率分别为1.28%和2.30%,查菲埃立克体核酸阳性率分别为6.41%和5.75%,无形体的核酸阳性率分别为1.28%和2.30%,鼠疫耶尔森菌均阴性。 其余鼠种均未检出相关病原。  结论  龙游县黑线姬鼠数量多,是多种重要传染病的潜在传染源,需重点监测,扩大相关病原谱的调查和监测,为自然疫源性疾病的预防控制提供依据。     

浙江省2008-2011年啮齿动物中汉坦病毒的分离及鉴定

目的 分析浙江省肾综合征出血热(HFRS)疫区鼠形动物携带汉坦病毒状况及其型别.方法 应用直接免疫荧光试验和RT-PCR方法检测汉坦病毒抗原和核酸,阳性者用长爪沙鼠和Vero-E6细胞进行病毒分离,对分离株的M片段基因进行序列测定和分析.结果 2008-2011年在浙江省HFRS疫区捕获的鼠形动物中以黑线姬鼠为优势鼠种;从该鼠鼠肺中共分离到6株汉坦病毒,序列分析表明分离株均为汉滩型汉坦病毒,其中Z521、524、534为H7亚型,TT-27、T-43、R88可能为新亚型;6株分离株之间的基因同源性较高,并与以往浙江省分离株具有较高同源性.结论 2008-2011年浙江省HFRS疫区鼠间存在汉滩型汉坦病毒流行.     

组氨酸激酶Ⅱ在伯氏疏螺旋体生活史中的功能

目的伯氏疏螺旋体组氨酸激酶Ⅱ(Hk2)和反应调节蛋白Rrp2共同组成一个二元信号系统,控制病原菌侵染哺乳动物所需致病因子的表达,但Hk2的生物学功能有待验证。方法应用同源重组方法得到hk2敲除菌株(hk2-),并利用蜱-鼠动物模型对其生物学功能进行探索。结果 hk2-能够通过人工针刺正常感染小鼠,间接免疫荧光试验显示在吸血的幼蜱和若蜱中肠能够检测到hk2-,定量PCR结果显示hk2敲除并不影响病原菌在若蜱中肠的繁殖,但在蜱叮咬状态下只有50%的小鼠能够被hk2-感染。结论Hk2不影响病原菌从鼠传播到幼蜱及随后在蜱体内的长期寄生,但hk2敲除降低了病原菌在自然条件下(蜱叮咬)感染小鼠的能力,研究结果暗示Hk2在病原菌生活史中的功能是协助病原菌高效地侵染哺乳动物。     

肠道病毒EV71型浙江分离株HZ08全基因组序列分析

目的了解浙江省流行的肠道病毒71型HZ08株的基因特征,研究肠道病毒71型的进化及变异状况。方法设计特异性引物,RT—PCR扩增HZ08株全基因,PCR产物纯化后克隆于T载体并进行序列测定和基因进化分析。结果HZ08株的全基因组由7405个核苷酸组成,编码2193个氨基酸。HZ08的5非编码区（UTR）、VPl、VP2、VP3、VP4、P2、P3、3非编码区（UTR）和全基因组的核苷酸与C4亚型的毒株序列较高,分别为96．2％～99．1％,92．6％～99．1％,92．7％～98．4％,88％～99．2％,93．8％～99．5％,89．4％～99．2％,91．4％～98．8％,87．8％～100％和91．1％～98．9％。HZ08株与其他亚型各区段的核酸同源性均低于90％。根据VPl基因和全基因序列进行种系统发生分析显示HZ08株与中国陆和台湾的病毒进化关系较近,与国际标准株以及东南亚毒株进化关系统较远。其中HZ08株与国内流行株BJ08和Fuyang08的进化关系最近。HZ08株与C4亚型相关氨基酸序列一致,VPl的抗原性表位发生了变异。结论HZ08病毒分离株为C4亚型,与Fuyang08和BJ08株进化途径相同,为肠道病毒7l型的基因组功能学和疫苗学研究奠定基础。     

杆状病毒为载体的重组汉坦病毒S基因在Vero—E6细胞中的表达及其生物活性

目的 将汉坦病毒HV Z10株S基因（HV5）插入已含CMV基因的杆状病毒转移载体pDual-CMV,筛选重组杆状病毒BAC-pDual-CMV-HVS,转化Vero-E6细胞,用于血清汉坦病毒抗体的检测。方法 以pEGFP-N1质粒为模板,通过PCR扩增CMV基因序列,酶切插入杆状病毒转移载体pFastTBacDUAL,构建含CMV的转移载体pDual-CMV。酶切含HV S基因的pMD19-Z10S质粒,插入pDual-CMV,构建pDual-CMV-HVS,转化感受态DH10BAC,筛选并取重组杆状病毒基因,转染TN细胞,筛选重组杆状病毒BAC-pDual-CMV-HVS。BAC-pDual-CMV-HVS转化Vero-E6细胞,制备抗原片,用于血清中抗汉坦病毒抗体的检测并与传统方法进行比较。结果 经测序成功构建重组杆状病毒转移载体pDual-CMV-HVS,按杆状病毒表达系统操作方法,成功筛选BAC-pDual-CMV-HVS,转化VeroE6细胞,经汉坦病毒抗体阳性血清检测,HV S基因在细胞中得到表达,与传统方法一致。结论 成功筛选BAC-pDual-CMV-HVS重组杆状病毒,可用于汉坦病毒抗原片的制备,该抗原片制备方法简便、无需特殊设备,可用汉坦病毒抗体的检测。     

东南沿海地区汉坦病毒的遗传进化分析

目的 对浙江、福建省及上海市东南沿海地区汉坦病毒的基因进行比较.方法 收集浙江、福建省及上海市汉坦病毒部分M基因序列,应用Mega 4.0和DNAStar软件包进行系统发生分析,以邻位相连法(NJ)构建系统发生树,分析东南沿海地区浙江、福建省及上海市汉坦病毒的基因差异,分析采用1000个多序列组.结果 经对浙江、福建省及上海市若干株汉坦病毒基因的序列比较与系统进化分析,浙江省分离的同型别毒株的基因序列同源性高于福建省与上海市的分离毒株,而浙江省同地区分离株的核苷酸同源性更高,地区接近的分离株系统进化分支的分布也大部分更靠近.汉滩型病毒(HTNV)福建株的ZH53和汉城型病毒(SEOV)浙江建德株Gou3和ZJ5与本研究同型别的其他株及国际标准株的核苷酸同源性较低,分别为82.7％～86.3％和84.0％～85.3％,而且分别在HTNV和SEOV发生群中构成一独立分支.浙江省从田鼠中分离到SEOV,产生宿主“溢出”现象.结论 浙江、福建省及上海市东南沿海地区汉坦病毒的基因差异和亲缘远近关系主要表现在地区性,显示出高度的地理聚集现象,浙江省建德地区和福建省分别存在SEOV和HTNV的特殊亚型病毒.     

2005 - 2017年邻近5省肾综合征出血热病毒演变规律与病原分子进化研究

目的 探索江苏、安徽、江西、浙江、福建这5个地理相邻的省份中重要虫媒传染病肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS）的病毒演化关系,为HFRS的预防提供理论依据。方法 根据以往疫情资料和疫区类型在这5省中选择14个HFRS疫区,应用分子流行病学方法全面、系统的研究该病的流行特征、时空演变规律和宿主与病原共进化关系等。结果 5个省份在地理上邻近,气候上属于亚热带和温带的过渡地区,为病毒宿主提供了良好的繁衍条件。黑线姬鼠和褐家鼠分别为汉坦病毒在野外和室内的主要传染源。通过构建系统发生树进行分析发现,从疫区鼠中分离的汉坦病毒（hantavirus,HV）基因与现有病毒有高度的同源性;研究HV基因时空演变规律与病原分子进化发现,汉滩型病毒（hantaan virus, HTNV）和汉城型病毒（seoul virus, SEOV）的基因差异和亲缘性主要表现为地区性。结论 江苏、安徽、江西、浙江、福建地区仍是肾综合征出血热汉滩型和汉城型的主要混合疫区,该研究结果可为我国丘陵地区的肾综合征出血热流行趋势预测及预防提供理论依据。     

浙江省天台县2011－2018年汉坦病毒基因型别和进化变异研究

目的 研究2011－2018年肾综合征出血热（HFRS）国家监测点浙江省天台县汉坦病毒（HV）的基因型别和进化变异情况，了解天台县HV分子流行病学特点。方法 将天台县2011－2018年HV抗原阳性的鼠肺标本超声后提取核酸，利用HV型特异性引物，应用巢式PCR对部分M片段进行扩增分型和序列测定，将天台县2011－2018年的HV序列与国内外其他已知的HV序列进行比较，以明确该地区的基因型别，分析病毒的进化变异情况。结果 HV抗原阳性的67份鼠肺标本经型特异性引物巢式PCR扩增后31份标本为阳性，其中30份为汉滩病毒（HTNV）、1份为汉城病毒（SEOV），31份PCR阳性鼠肺均来自黑线姬鼠。31份巢式PCR阳性产物的部分M片段核苷酸序列有30株分布在HTNV单元群，1株分布在SEOV单元群。HTNV单元群中的天台T2018-130株与天台其余29株及国内外其他株同源性为84.8%～87.9%，差异较大，天台其余29株亲缘关系较近； SEOV发生群中的T2016-31株来自黑线姬鼠的鼠肺标本，与SEOV天台以往分离株ZT71株、ZT10株和浙江温州分离株Z37株在系统发生树上分布于同一或临近分支。结论 浙江省天台县HV流行的主要型别HTNV基因表现出明显的地理聚集现象，但也存在着基因差异较大的变异株T2018-130株；同时从病毒基因序列分析证实SEOV T2016-31株存在于黑线姬鼠中，可能意味着在SEOV进化过程中病毒在宿主间发生了“溢出”现象。