人巨细胞病毒UL23基因编码蛋白的B细胞表位预测

目的 预测人巨细胞病毒UL23基因编码蛋白的B细胞表位.方法 应用互联网软件分析Hopp&Woods亲水性(Hydrophilicity)、可及性(Accessibility)、极性(Polarity)及柔韧性(Flexibility)、Welling抗原性(Antigencity)和二级结构(Secondary structures)等参数,用吴玉章等建立的B细胞表位预测法综合评价.结果 多种预测法重复了人巨细胞病毒UL23开放阅读框编码蛋白的N端第27～43、104～119、125～160位氨基酸区域内或附近,该区域含有B转角和无规卷曲结构,板可能是B细胞识别表位.结论 为应用合成肽或原核表达大片断蛋白制备抗人巨细胞病毒UL23基因编码蛋白的抗体提供了依据.     

重组人巨细胞病毒的转染、培养及其表型鉴定

[目的]对重组人巨细胞病毒进行体外包装培养并鉴定,为该病毒基因组功能研究提供稳定的实验材料.[方法]用试剂盒抽提、纯化重组人巨细胞病毒Towne基因组(Towne-BAC),构建pcDNA3.1(+)-UL82表达质粒;将Towne-BAC与pcDNA3.1(+)-UL82共转人胚肺成纤维细胞;培养病毒、观察细胞病变,抽提病毒RNA;设计人巨细胞病毒IE1、UL138、UL145基因PCR引物并扩增序列, 电泳鉴定. [结果]成功构建pcDNA3.1(+)-UL82,Towne-BAC与pcDNA3.1(+)-UL82共转后发生细胞病变;重组病毒的细胞培养物中分别检测到IE1、UL145基因表达,无UL138基因表达. [结论]成功包装出重组人巨细胞病毒,表型与Towne株吻合.     

ATPase 抑制因子1是与HCMV pUL23蛋白相作用的宿主蛋白分子-酵母双杂交技术筛选与鉴定

目的： 利用酵母双杂交技术筛选与人巨细胞病毒相互作用的宿主蛋白分子,为探讨人巨细胞病毒pUL23蛋白在HCMV生活周期中的作用机制提供依据。方法: 利用GAL4酵母双杂交系统筛选人胚肾cDNA文库,以获得与人巨细胞病毒pUL23蛋白相互作用的宿主蛋白分子,再通过回交试验和体外GST-pulldown试验验证两者之间的相互作用。结果: 酵母双杂交筛选得到宿主蛋白分子ATPase inhibitory factor 1（ATIF1）,回交试验和体外GST-pulldown试验再次确认ATIF1能够与人巨细胞病毒pUL23蛋白相互作用。结论: pUL23确实能够与ATIF1相互作用,它们之间的相互作用可能为研究pUL23在病毒生活周期发挥的功能提供依据。     

Prosaposin基因哺乳动物细胞表达质粒的构建及稳定转染细胞系的建立

目的构建前凋亡因子prosaposin的哺乳动物细胞表达质粒,转染NIH3T3细胞,建立稳定转染prosaposin的细胞系。方法采用PCR方法扩增prosaposin的开放阅读框,酶切后的PCR扩增产物和退火后的人工合成的c—Myc抗原表位标签,共同克隆至pcDNA3．1（＋）哺乳动物细胞表达载体中,构建pcDNA—Psap—Myc融合表达质粒。用脂质体将经过验证、测序的pcDNA-Psap—Myc质粒转染NIH3T3细胞,通过G418筛选建立稳定过表达prosaposin的NIH3T3细胞系。采用RT-PCR和western blotting方法,检测prosaposin在稳定转染的N1H3T3细胞系中的表达。结果成功构建了pcDNA-Psap-Myc融合表达质粒．建立了稳定过表达prosaposin的NIH3T3细胞系。RT—PCR和Western blotting结果表明,构建的稳定细胞系中成功表达prosaposin—Myc融合蛋白。结论Prosaposin哺乳动物细胞表达质粒的成功构建和稳定转染NIH3T3细胞系的建立,为进一步体外研究prosaposin蛋白的功能及其与其他分子间的相互作用奠定了基础。