肾综合征出血热疫苗后备筛选毒株在Vero细胞上的适应传代及其抗原性研究

〔目的〕将肾综合征出血热疫苗后备毒株适应于Vero细胞 ,观察病变情况 ,并对其抗原性和繁殖特性进行研究。〔方法〕将新分离的汉坦病毒ZJ2、ZJ4、ZJ7株和汉城病毒ZJ5株在Vero细胞上进行连续传代 ,采用间接免疫荧光法(IFA)、反向被动血凝试验 (RPHA) ,研究传代后毒株的病毒滴度、抗原量以及细胞的病变情况 ,同时将传代后的病毒接种敏感动物 ,观察动物的发病情况和毒株的繁殖特性。〔结果〕经过 5次连续传代 ,四株病毒在Vero细胞上均显示出良好的适应性 ,从第二代开始病毒滴度稳定在 6.0 0LgTCID5 0 ml以上 ,第五代时最高达 7.5 0LgTCID5 0 ml ,第三代毒株抗原量均已达到 1:12 8,ZJ7株抗原量最高时达 1:768,四株毒株感染Vero细胞 ,连续观察 12d不见细胞产生病变 ,第五代细胞病毒液接种敏感动物 ,9d后动物发病甚至死亡。〔结论〕四株病毒已适应于Vero细胞 ,且具有病毒滴度高、毒力强和抗原性良好的特性 ,是Vero细胞肾综合征出血热灭活疫苗良好的后备筛选毒株。     

汉坦病毒汉城型浙37株G1、G2包膜糖蛋白基因重组体的构建及在真核细胞中的表达

目的：构建汉坦病毒浙37（Z37）株包膜糖蛋白基因G1、G2真核表达质粒，并在真核细胞中表达。方法：根据Z37M基因序列设计6条引物，分别以质粒pGEMZ37,pCUMZ37为模板，通过聚合酶链反应（PCR）获得G1及G2片段。将G1、G2片段经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切片插入至真核表达载体pcDNA3.1( ），经酶切鉴定，并测序证实。以磷酸钙沉淀法分别将重组质粒转染COS－7细胞，用间接免疫荧光法（IFA）检测瞬时表达的蛋白。结果：获得分别含有编码汉坦病毒（HV）Z37株包膜糖蛋白G1、G2基因的重组质粒pcDNA3.1-g1,pcDNA3.1-G2；在转染的COS－7细胞内，用IFA可检测到细胞内有特异性荧光。结论：成功地构建了HV Z37株包膜糖蛋白G1、G2基因真核表达载体，并可在COS－7细胞中瞬时表达。     

II型登革病毒NS1基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

目的获得II型登革热病毒NS1基因并在昆虫细胞中表达,为进一步研发登革热血清学检测试剂盒提供抗原。方法RT-PCR扩增II型登革热病毒NS1基因并测序列,并定向克隆入杆状病毒转移载体pFastBac-HTA,获得重组转移载体pFastBac-NS1。并将pFastBac-NS1转化到DH10Bac感受态细胞中,筛选到重组转座子rBacmid-NS1。在脂质体介导下将rBacmid-NS1转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒rBV-NS1。rBV-NS1感染Sf9细胞后,通过SDS-PAG和Western blot检测NS1重组蛋白。结果成功克隆II型登革病毒NS1基因,SDS-PAGE、间接免疫荧光和Western blot检测表明NS1基因在昆虫细胞得到表达,能与登革患者血清发生特异性免疫反应,具有免疫原性。结论II型登革病毒非结构蛋白NS1在昆虫中表达,为进一步研究NS1的生物学特性和血清学检测奠定基础。     

Ⅱ型猪链球菌浙江分离株cps2J、ef、mrp基因的克隆及序列分析

目的阐明浙江省猪链球菌分离株的血清型分型,分析其与国内外其他猪链球菌Ⅱ型（SS2）菌株 cps2J、ef、mrp毒力基因的差异。方法参照GenBank上已发表的cps2J、ef、mrp毒力基因序列,设计引物 ,对6株浙江省猪链球菌分离株进行cps2J、ef、mrp全基因克隆及序列测定,并与国内外其他分离株的基 因序列进行比较。结果cps2J、ef、mrp基因的完整开放阅读框（ORF）分别为999bp、2532bp、3771bp,各 自编码333、843、1256个氨基酸。经对cps2J、ef、mrp毒力基因的序列比较与系统进化分析,6株浙江分 离株均分布在SS2发生群中,与国内外其他SS2菌株cps2J、ef、mrp基因核苷酸的同源性均较高,分别为 98.39%～100.0%、99.6%～100.0%和99.4%～100.0%,分离的年代和地区对基因的同源性和系统进化分支影 响不大。结论6株浙江省猪链球菌分离株为2型菌株,cps2J、ef、mrp基因序列非常保守,与GenBank上国 内及欧洲SS2菌株中相应序列有很高的同源性,可能有着相同的起源。     

汉坦病毒N蛋白的重组表达及其用于IgM直接捕捉ELISA的建立和应用

目的克隆并表达汉坦病毒（HV）Z10株（HV—Z10）N蛋白（NP）编码基因，建立基于辣根过氧化酶（HRP）标记重组NP（rNP）的rNP—IgM直接捕捉ELISA，检测肾综合征出血热（HFRS）患者血清并评价其检测效果。方法PCR扩增HV—Z10株NP编码基因，基因工程方法构建NP编码基因原核表达系统pET28a—Z10N—E．coli BL21DE3。SDS-PAGE了解rNP表达情况，离子交换法和Ni—NTA亲和层析法提纯rNP。Western blot检测rNP的特异性免疫反应性。建立HRP标记rNP—IgM直接捕捉ELISA检测HFRS患者血清样品，并与常规HV—IgM间接捕捉ELISA进行比较。结果pET28a—Z10N—E．coli BL21DE3高效表达rNP。提纯rNPSDS-PAGE显示单一蛋白条带，HV-IgG能有效识别rNP并与之结合。94．73％（90／95）HFRS患者血清样品rNP—IgM直接捕捉ELISA检测结果阳性，HV—IgM间接捕捉ELISA阳性率为92．63％（88／95）。两种IgM捕捉ELISAs检测的HFRS患者血清样品A450值分布及对多份不同稀释度血清检测的A450，均值变化均相似。结论成功构建了HV—Z10株NP编码基因高效原核表达系统。所建立的rNP—IgM直接捕捉ELISA可作为HFRS简便、安全、敏感、特异的血清学诊断新方法。     

肾综合征出血热病毒高效价免疫血清抗体毒株的筛选

肾综合征出血热（HFRS）是由布尼亚病毒科汉坦病毒属引起的急性传染病。在HFRS病毒和疫苗的研究工作中，常采用间接免疫荧光抗体（IFA）技术和直接荧光抗体（FA）技术。利用高效价兔抗HFRS病毒免疫血清制备的荧光血清在检测HFRS病毒抗原：亡作中，具有特异、快速的优点忙，而荧光血清的质量与免疫血清的效价有直接关系，不同生物学特性的HFRS毒株免疫敏感动物家兔后，其免疫血清的效价有一定的差异。因此，能产生高效价免疫血清的毒株筛选是制备高质量荧光血清的关键。     

计算机在省级卫生防疫站管理中的应用

随着计算机在各行业中的广泛应用,在防疫系统内,从最初仅在完成疫情数据的上报,发展到计划免疫、食品卫生、环境卫生、劳动卫生、放射卫生、学校卫生及卫生监督人员的月报、季报、年报数据的统计与上报。目前,各级防疫站使用的成熟软件,大部分是预防医学科学院下发的,而各防疫站自身开发的软件很少,软件需求又很迫切。本文重点讨论如何加强计算机在省级卫生防疫站管理中的开发与应用。基本情况1．硬件设施我站共28个科所,现有60多台计算机,机型有386、486、586、PENTIUM,外部设备有激光、喷     

浙江省2000年肾综合征出血热监测分析

为探索肾综合征出血热 (HFRS)流行特征 ,以制定有针对性的防治措施。采用间接免疫荧光法 (I FAT)检测EHF病人血清中抗体 ,采用直接免疫荧光法 (FAT)检测鼠肺汉坦病毒 (HV)抗原。结果表明 ,全省 15 0 7例病人 ,主要分布在浙东和浙西丘陵区、浙南山区 ,5、6月及 12月和翌年 1月为二个发病高峰 ,青壮年农民发病最多。今后应对以姬鼠型为主的混合型疫区选择双价疫苗进行预防接种 ,以降低发病率。     

SARS冠状病毒CT基因型发现及相关特征

目的 研究SAPS冠状病毒基因型及相关特征。方法 对杭州市首例SAPS病人分离的SAPS冠状病毒ZJ01株进行全基因组测序，并在GenBank数据库登录。记录号：AY297028，版本号：gi：30910859。整个全基因组由29715bp组成。使用GeaBank数据库中最新登陆的SARS病毒的基因组进行序列比对、突变点分析和多态性分析、特殊片段的系统进化分析。结果 发现在ZJ0l株的9391、17555、21712、22213和27819位点，分别是T、T、G、T和T核苷酸碱基，和CenBank数据库中的其他SARS冠状病毒株比较，除第l、2、4和5突变位点(C：G：C：C／T1 T1 T2 T)之外，发现在21712位点(第3个)A／G突变也参于这一遗传标识。因此我们提出5个突位点将17株病毒分为两种基因型的新概念，即C：G：A：C：C与T：T：G：T：T两型，简称C型和T型。ZJ01病毒株属于T基因型．在中国大陆内地是首次发现和发表。突起蛋白基因片断的进化树分析，广州的GZ01 C基因型株进化距离和其他病毒株相差甚远；比较而言，和C基因型BJ0l、CUHK-Wl病毒株较为接近，其次是T基因型的Fl和F2组。5个突变位点(C：G：A：C：C／T：T：G：T：T)的两个发生在编码突起蛋白(S)的基因中，分别是A／G和C／T突变，由此引起的突起蛋白(S)氨基酸变化是Asp／Gly(天门冬氨酸／甘氨酸)和Thr／Ile(苏氨酸／异亮氨酸)。结论 这些基因型特征和变异是否会引起生物学及临床症状的差异是非常值得重视的。