氨甲酰磷酸合成酶单克隆抗体的制备、鉴定及应用

目的:制备抗人氨甲酰磷酸合成酶(CPSI)的单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定与应用.方法:将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体,用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备 mAb,并通过间接ELISA法、Western blot、免疫组化及免疫荧光染色的方法对mAb进行特性鉴定,通过免疫沉淀联合质谱、Uni-ZAP XR表达文库筛选鉴定抗原,借助免疫捕获的方法用抗体来分离复合物.结果:获得3株可稳定分泌抗人CPSI mAb的杂交瘤细胞系.mAb的Ig亚类(型)为IgGl(K),该mAb可用于ELISA检测、Western blot、免疫组化、免疫荧光染色、免疫沉淀实验和复合物的分离.结论:成功制备了抗人CPSI的mAb,为CPSI的研究提供了有力的工具.     

醛脱氢酶8A1融合蛋白的表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

目的:重组表达醛脱氢酶8A1(aldehyde dehydrogenase 8 family member A1,ALDH8A1)蛋白,制备其多克隆抗体,并进行抗体的特异性鉴定,以及蛋白在组织和细胞内的定位。方法:以成人肝cDNA文库为模板,PCR扩增ALDH8A1目的片段,并构建重组表达载体pGEX-4T-1-ALDH8A1和pET-32a-ALDH8A1,经测序鉴定插入载体的DNA片段序列正确后,转化大肠杆菌BL21,诱导表达GST-ALDH8A1和His-AL-DH8A1融合蛋白。经Western blot确定其为目的蛋白后,纯化重组融合蛋白,并以GST-ALDH8A1免疫家兔制备抗人AL-DH8A1多克隆抗体。用His-ALDH8A1包板,ELISA法测定兔抗人ALDH8A1血清效价;Western blot鉴定兔抗人ALDH8A1血清在重组蛋白和天然蛋白中的反应特异性;免疫组化法确定ALDH8A1蛋白在组织和细胞中的定位。结果:成功构建重组表达载体pGEX-4T-1-ALDH8A1和pET-32a-ALDH8A1;获得包涵体形式表达的GST-ALDH8A1和可溶性形式表达的His-ALDH8A1融合蛋白;应用纯化的重组蛋白GST-AL-DH8A1免疫家兔,获得兔抗人ALDH8A1血清,ELISA测定抗血清的效价为1∶256000。Western blot结果显示,制备的AL-DH8A1兔多抗可特异地识别成人肝总蛋白以及293T、A549、HeLa、U937、HepG2细胞总蛋白中一个相对分子质量(Mr)约53000的ALDH8A1天然蛋白,与文献报道的ALDH8A1的Mr一致,表明ALDH8A1在正常肝组织与癌细胞中都有表达。免疫组化结果表明ALDH8A1蛋白定位于人肝癌细胞胞质中。结论:成功制备出兔抗人ALDH8A1多克隆抗体,此抗体可应用于ELISA,Western blot和免疫组化检测,为进一步研究ALDH8A1的功能奠定了基础。     

切胶免疫制备腮腺液高丰度蛋白多克隆抗体

目的 通过切胶免疫制备人腮腺液高丰度蛋白多克隆抗体,为下一步腮腺液高丰度蛋白单克隆抗体制备提供抗原解决方案.方法 将腮腺液经超滤法浓缩蛋白后,进行SDS-PAGE分析,切取分子量约为50-65kDa的高丰度蛋白条带,研磨后注射新西兰大耳白兔诱导产生免疫应答并制备兔抗人腮腺液高丰度蛋白多克隆抗体,并应用蛋白免疫印记(Western blot)等方法进行抗体鉴定.结果 成功制备和鉴定了人腮腺液高丰度蛋白多克隆抗体.结论 成功制备和鉴定了人腮腺液高丰度蛋白多克隆抗体,为下一步腮腺液高丰度蛋白单克隆抗体制备及唾液蛋白质组学研究奠定基础.     

高功率微波辐照小鼠免疫组织基因表达谱初步分析

目的：观察一定强度高功率微波(HPM)诱发的小鼠胸腺及淋巴结免疫组织差异基因表达谱的变化,揭示非热效应在分子水平上的作用机制。方法：应用cDNA基因芯片技术分析微波非热效应的分子机制。结果：(1)淋巴结上调的差异表达基因519个,下调基因305个;胸腺上调基因149个,下调基因205个。(2)差异表达基因的生物学功能主要涉及免疫反应及防御、细胞凋亡、DNA修复与复制、应激反应、信号转导、细胞粘附、细胞生长及周期、组织器官发生、物质代谢、细胞增殖等多个方面。结论(1)胸腺差异表达基因总数少于淋巴结,且胸腺差异基因上调及下调的幅度也低于淋巴结,表明淋巴结对HPM辐照的敏感性要高于胸腺。(2)HPM对机体免疫组织的影响可能属非热效应的作用机制,且涉及的差异基因范围也较为广泛。     

鼠抗人醛脱氢酶1A1单克隆抗体的制备与鉴定

醛脱氢酶1A1（ALDH1A1）是醛脱氢酶家族的成员之一，以同源四聚体的形式存在，定位于细胞质，在肝脏、胰腺、生殖器和皮肤成纤维细胞中高表达。ALDH1A1具有视网膜脱氢酶、醛脱氢酶（NAD）、氧化还原酶活性，参与体内多种醛类代谢，氧化不同的脂肪族醛和芳香族醛变成相对应的羧基酸，并具有电子传递及药物解毒的功能。目前市售的抗ALDH1A1抗体均为多克隆抗体，我们在成人抗肝脏胞质蛋白单克隆抗体（mAbs）库的建立过程中，应用细胞质总蛋白免疫BALB／c小鼠得到多株mAbs，其中1株经鉴定确认为鼠抗人ALDH1A1单克隆抗体，并对其特异性进行了鉴定，为进一步研究ALDH1A1的功能提供了特异性检测工具。[第一段]     

Somatix公司关于基因治疗的申请

Somatix公司计划在今年年底之前开展其获准的第一项基因治疗的尝试,以用于肾癌的治疗。这一尝试将在Johns Hopkins大学进行,包括取出病人的癌细胞,利用该公司适当的载体将GM-CSF基因插入细胞,再把改造后的细胞回输病人,使其发挥“疫苗”的作用,对抗癌细胞。这一探讨在小鼠的肿瘤模型上非常见效,但是否能成功地适用于人体还不能肯定。如果这一方案获得成功的话,该公司计划于1993年下半年或1994年上半年开始临床Ⅱ、Ⅲ期试验。这一基因治疗的策略还可以将其他细胞因子如IL-2、IL-4等应用于其他种     

分泌抗人IgA单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立与鉴定

利用常规杂交瘤技术制备了一株抗人IgA杂交瘤PA_(229) ELISA结果表明,它分泌的抗体与人IgA有特异性反应,而与其它免疫球蛋白重、轻链无交叉反应,为小鼠IgG_1亚类。免疫转印结果只显示针对IgAα链的一条电泳带。用改良ELISA法测得PA_(229)的亲和常数为1.33×10~8L/mol。     

Sialin(SLC17A5)在腮腺、颌下腺及颌下腺细胞系HSG表达的初步分析

目的研究唾液酸转运蛋白Sialin在正常涎腺组织和颌下腺细胞系HSG的表达.方法应用基因芯片检测正常人腮腺、颌下腺组织Sialin编码基因SLC17A5的表达;提取腮腺、颌下腺组织及颌下腺细胞系(HSG)总RNA,通过RT-PCR在基因水平上验证SLC17A5基因的表达;提取HSG细胞总蛋白,用免疫印迹法检测Sialin在蛋白水平表达.结果基因芯片检测到Sialin编码基因SLC17A5基因在正常人腮腺、颌下腺均有表达,表达比值分别为226、206.9,不存在表达差异;RT-PCR验证芯片结果并在其他涎腺样本及颌下腺细胞系HSG中能扩增出其全部翻译区1485bp的片段,应用商业化的抗体能够在HSG细胞检测到Sialin相应的约54KDa蛋白.结论正常腮腺、颌下腺组织和颌下腺细胞系HSG均表达SLC17A5基因,但是唾液酸转运蛋白Sialin在组织、细胞内定位和功能需要进一步研究.     

烯脂酰辅酶A水解酶单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备小鼠抗人烯脂酰辅酶A水解酶(enoyl CoA hydratase,ECHS1)的单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定.方法:将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体,用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备mAb,并通过间接ELISA、Western blot、免疫沉淀、免疫组化和间接免疫荧光等方法对mAb进行特异性鉴定,通过Uni-ZAP XR正常成人肝脏cDNA表达文库筛选鉴定抗原.结果:获得1株可稳定分泌抗人ECHS1 mAb 的杂交瘤细胞株BGB095.该mAb的Ig亚类(型)为IgG1(κ),可用于ELISA检测、Western blot、免疫沉淀、免疫组化等实验.结论:成功制备了抗人ECHS1的mAb,为代谢疾病和肿瘤的研究提供了有力的工具.