抗人肝癌单克隆抗体嵌合Fab在巴氏毕赤酵母中的高效分泌表达

目的:通过分步整合,用巴氏毕赤酵母表达抗人肝癌单克隆抗体(mAb)HAb18的嵌合Fab(cFab)片段。方法:将抗人肝癌mAbcFab/HAb18基因的原核表达载体pET32a/cFab中的CL和Fd段基因,分别亚克隆到酵母表达载体pPIC9K和pPICZαA中,构建重组质粒pPIC9K/CL和pPICZαA/Fd并测序鉴定。将重组质粒pPIC9K/CL和pPICZαA/Fd分步整合到酵母菌GS115的染色体上,经G418和Zeocin筛选高拷贝的转化子及鉴定Mut表型后,用含5mL/L甲醇的培养基诱导表达。结果:成功地表达抗人肝癌mAbHAb18的cFab,表达水平为26mg/L。Westernblot鉴定证实,表达产物具有良好的与HAb18结合的活性和特异性。结论:cFab/HAb18在巴氏毕赤酵母获得表达,为对其进一步大规模的生产和临床应用奠定了基础。     

HAb18G/CD147刺激人肝癌细胞分泌基质金属蛋白酶的机制探讨

目的探讨HAb18G/CD147诱导肝癌细胞基质金属蛋白酶(MMP)分泌和活化的机制.方法应用明胶酶谱分析方法观察HAb18G/CD147分子及其细胞内、外片段高表达对人SMMC-7721肝癌细胞分泌MMP(MMP-2和MMP-9)及其活化的影响,以及细胞内Ca2 信号调控在此过程的作用.结果HAb18G/CD147分子的高表达明显诱导MMP-2和MMP-9的分泌和活化,分泌总量升高(30.45±3.41)%(P＜0.01),而细胞内、外各片段的表达均不能有效刺激MMP的分泌与活化.细胞内Ca2 库释放诱导剂Thapsigargin(Tg)在未转染7721细胞可有效诱导MMP-2和MMP-9的分泌与活化,较对照组升高(58.63±31.04)%(P＜0.05),其诱导作用可受到细胞内Ca2 调节抑制剂S-亚硝基-乙酰青霉胺(S-nitroso-N-acetylpenicillamine,SNAP)的明显抑制,而HAb18G/CD147的高表达则抑制了以上细胞内Ca2 信号通路对MMP分泌和活化的调节作用,使转染的T7721细胞MMP的分泌与活化始终处于高水平稳定状态.结论全长的HAb18G/CD147分子可通过抑制细胞内Ca2 信号调控通路诱导肝癌细胞稳定高表达和活化MMP.     

抗人肝癌基因工程嵌合Fab抗体的原核表达及复性

目的　分别在大肠杆菌中高效表达嵌合Fd及嵌合轻链 ,并进行嵌合Fab复性的研究。方法　分别将嵌合Fd及嵌合轻链基因插入到原核表达载体pET32a中 ,构建成重组载体pET32a/cFd和pET32a/cL。转化大肠杆菌后诱导其表达。大量制备表达的嵌合Fd及嵌合轻链后 ,按二者绝对量等摩尔比混合后进行透析复性。然后 ,分别利用SDS PAGE、Westernblot和ELISA进行分析和鉴定。结果　成功获得了嵌合Fd及嵌合轻链的原核非融合高效表达 ,表达蛋白相对分子质量 (Mr)均在 2 4×10 3 左右。表达量分别约占菌体总蛋白的 2 8.3%和 32 .3% ,2种目的蛋白均主要以不溶性的包涵体形式存在。另外 ,嵌合Fd与嵌合轻链在缓慢透析的条件下成功地复性为嵌合Fab抗体 ,Mr 约为 4 2×10 3 ,具有特异性抗原结合活性和良好的亲和力。在起始总蛋白浓度为 10 0 μg/ml时 ,复性效率约为4 9 %。结论　成功实现了嵌合Fab抗体的高效表达及高效复性 ,为进一步探讨其在肝癌治疗中的应用奠定了基础     

免疫亲和层析纯化大肠癌相关抗原

目的 :从培养的大肠癌细胞Hce 86 93中分离纯化并鉴定大肠癌相关抗原。方法 :利用流式细胞术选择高表达大肠癌相关抗原的大肠癌细胞系 ,分别用单去污及三去污裂解液裂解细胞。然后用 5株抗大肠癌单克隆抗体 (mAb)CYL 1～CYL 5进行Westernblot,分析与大肠癌细胞结合反应最强的mAb。以此mAb作为配基进行亲和层析纯化大肠癌相关抗原 ,纯化结果利用Westernblot法进行鉴定。结果 :大肠癌细胞系Hce 86 93上相关抗原的表达量最高 ;抗大肠癌mAbCYL 2与Hce 86 93的结合力最强。纯化所获与CYL 2特异结合的大肠癌相关抗原 ,Mr 约为 13× 10 3 。该抗原由Mr 为 6 0× 10 3 和70× 10 3 两种亚基组成。结论 :利用mAbCYL 2进行亲和层析 ,从大肠癌细胞系Hce 86 93中获得纯化的肿瘤相关抗原。     

对生物医学研究生开设生物医学实验安全课程的必要性探讨

通过对当前生物医学发展与生物安全现状分析，探讨在生物医学研究生课程中设置生物医学实验安全课程的必要性。     

抗人肝癌基因工程嵌合抗体的构建及在Sp2/0细胞的稳定表达

目的　构建抗人肝癌嵌合抗体 ,并在Sp2 0细胞中进行稳定高效表达。方法　分别将HAb18轻、重链可变区基因克隆入真核表达载体pDHL构建重组载体pDHL chHAb18。酶切及测序鉴定后 ,转染Sp2 0细胞 ,经甲氨蝶蛉 (MTX)筛选获得抗性克隆。采用有限稀释法单克隆化后持续MTX加压培养。通过ELISA筛选高效表达的单克隆细胞株。表达产物纯化后 ,进行SDS PAGE和Westernblot检测 ,同时采用ELISA和免疫荧光法检测其抗原结合特异性。结果　成功构建了重组嵌合IgG抗体chHAb18的真核表达载体pDHL chHAb18。转化Sp2 0细胞后 ,初步筛选得到了高效表达chHAb18的细胞株。经MTX加压培养 ,1株细胞的chHAb18表达量达到 10mg L。SDS PAGE和Westernblot检测结果表明 :目的蛋白分子质量约为 16 0× 10 3,还原后为 2条带 ,分子质量约为 5 2× 10 3和 2 7× 10 3。上述蛋白条带均与羊抗人IgG抗体特异结合。结论　成功构建了抗人肝癌基因工程嵌合抗体chHAb18,并在骨髓瘤细胞中获得高效表达。为其进一步的应用研究奠定了基础。     

抗人HAb18G分子单链抗体基因的构建及在大肠杆菌中的分泌表达

目的 :构建抗人HAb18G分子单链抗体基因 ,并在大肠杆菌中进行分泌表达。方法 :通过连接肽 (Gly4Ser) 3基因序列将已成功克隆的抗人肝癌单抗HAb18轻、重链可变区基因拼接成单链抗体 (ScFv)基因 ,并在 5′和 3′端引入相应的酶切位点 ,克隆至改造的分泌性表达载体pCANTAB 5His之中 ,转化到E coliHB2 15 1中进行诱导表达。亲和层析纯化表达蛋白后 ,以SDS PAGE电泳、Westernblot及ELISA等方法分析检测表达产物。结果 :经限制性酶切鉴定及DNA测序分析 ,证实基因构建正确。SDS PAGE电泳和Westernblot分析表明ScFv基因在大肠杆菌中成功表达。表达产物的相对分子质量 (Mr)为 31kD ,与理论预期值相符 ,并且可与相应的抗原特异结合。结论 :成功实现了抗人HAb18G分子单链抗体的原核分泌表达 ,为其在人肝癌诊治中的进一步应用奠定了基础。     

细胞生物学讨论课教学改革尝试

为了激发学员学习细胞生物学的积极性 ,加强全面素质教育 ,提高教学质量 ,我们组织了细胞生物学讨论课 ,并进行了问卷调查 ,结果显示 ,学员增强了对细胞生物学的学习兴趣 ,同时综合分析能力也得到了提高 ,并在学习过程中建立了互动式学习模式