慢性髓细胞性白血病患者与健康人骨髓单个核细胞基因表达的差异

背景：慢性髓细胞性白血病是以造血干细胞的恶性克隆性增殖为特征。慢性期的慢性髓细胞性白血病患者如果不予以有效的治疗，必然演进为急变期。其预后往往非常差。因而，从全基因组水平上阐明慢性髓细胞性白血病的发生机制显得尤为重要，目的：应用Applied Biosystems表达芯片系统对慢性髓细胞性白血病患者骨髓单个核细胞的基因表达谱进行观察。设计：观察对比分析。单位：南方医科大学基因工程研究所。对象：两例骨髓样品（1例慢性髓细胞性白血病患者，1例健康者）来自于广州军区广州总医院血液科。方法：实验于2004-10／2005—09在南方医科大学基因工程研究所完成。分别从一例慢性髓细胞性白血病患者与一例健康人的骨髓样品中分离单个核细胞，提取总RNA，纯化mRNA。通过逆转录体外线性扩增的方法对mRNA样品进行标记，将标记好的cRNA样品与芯片杂交。利用ABI1700化学发光芯片分析仪对骨髓单个核细胞的基因表达谱差异情况进行分析。通过比较同一样品不同芯片间的数据信息，对芯片结果的可重复性进行评估。主要观察指标：①总RNA及标记后的cRNA质量的评定。②芯片可重复性验证。③芯片杂交结果。④半定量反转录-聚合酶链反应结果。结果：①利用统计学数据分析工具，通过比较慢性髓细胞性白血病患者与健康人单个核细胞的基因表达差异，总共发现了6706个差异基因。其中，与慢性髓细胞性白血病密切相关的差异基因为68个，上调的有17个，下调的有51个。③位于C／EBPalpha信号通路和CD40受体信号通路中的大部分差异表达基因，其表达水平降低。③通过对重复实验结果的相关性及检测一致性分析，证实了芯片结果的可重复性较好。而两组重复实验间的相关系数分别是，慢性髓细胞性白血病组为0．991，健康组为0．988。④半定量反转录-聚合酶链反应验证了芯片分析结果的可靠性。结论：通过比较慢性髓细胞性白血病患者与健康人单个核细胞的基因表达谱的差异，发现了大量的差异表达基因。这些数据将为寻找可用于慢性髓细胞性白血病患者疾病治疗的分子靶标提供有用的信息。     

慢性髓细胞性白血病患者与健康人骨髓单个核细胞基因表达的差异

背景:慢性髓细胞性白血病是以造血干细胞的恶性克隆性增殖为特征。慢性期的慢性髓细胞性白血病患者如果不予以有效的治疗,必然演进为急变期,其预后往往非常差。因而,从全基因组水平上阐明慢性髓细胞性白血病的发生机制显得尤为重要,目的:应用AppliedBiosystems表达芯片系统对慢性髓细胞性白血病患者骨髓单个核细胞的基因表达谱进行观察。设计:观察对比分析。单位:南方医科大学基因工程研究所。对象:两例骨髓样品(1例慢性髓细胞性白血病患者,1例健康者)来自于广州军区广州总医院血液科。方法:实验于2004-10/2005-09在南方医科大学基因工程研究所完成。分别从一例慢性髓细胞性白血病患者与一例健康人的骨髓样品中分离单个核细胞,提取总RNA,纯化mRNA。通过逆转录体外线性扩增的方法对mRNA样品进行标记,将标记好的cRNA样品与芯片杂交。利用ABI1700化学发光芯片分析仪对骨髓单个核细胞的基因表达谱差异情况进行分析。通过比较同一样品不同芯片间的数据信息,对芯片结果的可重复性进行评估。主要观察指标:①总RNA及标记后的cRNA质量的评定。②芯片可重复性验证。③芯片杂交结果。④半定量反转录-聚合酶链反应结果。结果:①利用统计学数据分析工具,通过比较慢性髓细胞性白血病患者与健康人单个核细胞的基因表达差异,总共发现了6706个差异基因。其中,与慢性髓细胞性白血病密切相关的差异基因为68个,上调的有17个,下调的有51个。②位于C/EBPalpha信号通路和CD40受体信号通路中的大部分差异表达基因,其表达水平降低。③通过对重复实验结果的相关性及检测一致性分析,证实了芯片结果的可重复性较好。而两组重复实验间的相关系数分别是,慢性髓细胞性白血病组为0.991,健康组为0.988。④半定量反转录-聚合酶链反应验证了芯片分析结果的可靠性。结论:通过比较慢性髓细胞性白血病患者与健康人单个核细胞的基因表达谱的差异,发现了大量的差异表达基因。这些数据将为寻找可用于慢性髓细胞性白血病患者疾病治疗的分子靶标提供有用的信息。     

青蒿素作用前后K562细胞基因表达谱的改变

目的:利用基因表达谱芯片研究青蒿素对体外培养的人红白血病K562细胞基因表达谱的影响.方法:青蒿素处理K562细胞24 h后,分别提取处理组和对照组细胞的总RNA,将两组RNA纯化为mRNA,逆转录成cDNA,用Cy3和Cv5两种不同的荧光染料进行线性扩增标记,与人全基因组基因表达谱芯片杂交,采用生物信息学方法分析青蒿素处理前后K562细胞基因表达谱的改变.结果:总共发现差异基因238个,其中上调基因136个,下调基因102个,并对其进行生物学功能分类.结论:应用全基因组表达谱芯片并结合Panther生物学软件分析差异表达基因,青蒿素作用K562细胞主要是通过细胞毒作用诱导细胞凋亡,而抑制细胞生长作用并不明显.     

两种基因芯片杂交法荧光信号的比较研究

目的:探讨样品在流动态和静置态两种杂交环境下分别与基因芯片进行杂交,比较两种方法对杂交信号的影响。方法:人红白血病K562细胞mRNA经限制性荧光标记后在循环流动的杂交环境和传统静置的杂交环境中分别与K562表达谱芯片杂交,在同等条件下进行杂交后的清洗和芯片扫描检测。结果:流动态的样品相对于静置态的样品与芯片杂交产生的杂交信号荧光背景低,灵敏度和信噪比高,并且杂交点的同一性好。结论:样品在流动态与芯片杂交得到的杂交效果要好过传统的杂交方法,从而为基因芯片的实际应用提供了新的研究方法和思路。     

靶向COL1A1基因的 shRNA对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖与凋亡的影响

 目的：探讨抑制Ⅰ型胶原α1链（COL1A1）基因表达对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖及凋亡的影响。方法：用已构建的pSilencer2.1-U6-COL1A1重组质粒转染乳腺癌细胞MDA-MB-231,采用RT-PCR和Western blotting技术检测重组质粒对COL1A1基因表达的影响,MTT比色法测定细胞增殖的抑制情况,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡的变化,Hoechst 33258荧光染色观察细胞凋亡的形态学变化。结果：RT-PCR及Western blotting结果证实重组质粒在mRNA和蛋白水平分别显著抑制COL1A1基因表达;pshRNA-COL1A1转染组细胞的增殖速度明显减慢且呈时间依赖关系;与对照组相比,pshRNA-COL1A1组细胞明显阻滞于G₀/G₁期,细胞凋亡率显著升高（P<0.05）,出现细胞质浓缩、核凝聚等凋亡形态学变化。结论：pshRNA-COL1A1能有效抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖,并诱导其凋亡,为以COL1A1为靶点的乳腺癌基因治疗提供实验依据。     

MiR-138对MCF-7细胞端粒酶活性及端粒稳定性的调控作用

 目的 研究MiR-138通过HTERT作为下游靶基因,对人乳腺癌MCF-7细胞端粒酶活性的调控作用及端粒稳定性的影响。方法 在人乳腺癌MCF-7细胞中瞬时转染MiR-138 模拟物,用MTT法检测细胞增殖活性,并于转染后48h,用实时定量RT-PCR检测端粒酶催化亚单位HTERT表达、TRAP Assay检测端粒酶活性,同时对细胞进行53BP1 抗体免疫荧光染色及端粒的FISH染色。结果 转染后48h,MiR-138模拟物处理的MCF-7细胞HTERT表达水平比对照细胞降低2.18倍(2-△△Ct),端粒酶活性比对照细胞降低2.69倍,53BP1聚集形成的凝集点（Foci）,部分与端粒位点重合,比率达到20.62%±1.55% 。结论 MiR-138以HTERT作为下游靶分子,调控MCF-7细胞端粒酶活性,影响细胞端粒稳定性。     

石参提取物改善胰岛素抵抗的HepG2细胞糖代谢的作用及其机制研究

目的探讨石参提取物对胰岛素抵抗(IR)的HepG2细胞糖代谢的改善作用及其可能的机制。方法用CCK-8法检测棕榈酸及石参提取物对HepG2细胞活力的影响;建立稳定的胰岛素抵抗模型后,用试剂盒检测细胞上清中葡萄糖含量和细胞内己糖激酶及葡萄糖-6-磷酸酶活性;用RT-PCR法检测GLUT-2、PDK-1、PEPCK-1以及PGC-1α的转录量;用Western Blot法检测IRS-1、AKT、p-AKT、FOXO1、p-FOXO1蛋白表达量。结果石参提取物能显著减少IR的HepG2细胞上清中葡萄糖含量,并可在增强己糖激酶活性的同时抑制葡萄糖-6-磷酸酶活性,该作用可能与药物能显著增强Akt及FoxO1的磷酸化,进而增强PI3K通路作用有关。结论石参提取物能有效改善IR的HepG2细胞的糖代谢,其机制可能与药物改善PI3K/Akt通路活性有关。     

一种用于微阵列分析的通用引物U2联合标记方法

目的报告一种新的用于微阵列研究的荧光标记技术：通用引物U2联合标记技术(UPL);比较UPL与随机引物等其他标记方法的效率和可重复性。方法分别用4种标记方法标记流感病毒RNA样品,与流感病毒寡核苷酸检测芯片杂交后,用Spss10．0软件对杂交结果进行分析。结果UPL方法在标记物杂交的荧光强度、信噪比、探针真阳性率和可重复性等方面均高于随机引物逆转录掺入标记法,而与其他两种RD标记方法相当,但标记过程相对更加简单。结论UPL方法是一种新颖而有效的标记方法,在微阵列技术研究方面具有广泛的应用价值。     

干扰HTERT降低人乳腺癌MCF-7细胞对γ射线引起的DNA损伤反应

 目的 研究HTERT RNA干扰对人乳腺癌MCF-7细胞γ射线照射引起的DNA损伤反应的影响。方法 通过逆转录病毒为载体的HTERT-siRNA,抑制人乳腺癌MCF-7细胞中端粒酶催化亚单位HTERT表达,实时定量RT-PCR及Western blot确认HTERT表达水平、用137Cs放射源以3 Gy剂量γ射线照射细胞,于照射前以及照射后1、2、4、8和12h收集细胞,采用磷酸化53BP1 抗体进行免疫荧光染色,并于照射前、照射后1、4和12h收集细胞,Western blot检测53BP1蛋白磷酸化水平。结果 HTERT-siRNA处理的细胞HTERT表达水平比对照细胞降低3.20 (2-△△Ct)倍, HTERT蛋白水平降低2.56倍。HTERT-siRNA处理的细胞对γ射线引起的DNA损伤反应显著降低。结论 RNA干扰HTERT表达水平,可以降低人乳腺癌MCF-7细胞对γ射线照射引起的DNA损伤反应。     

microRNA与血液系统肿瘤的研究进展

微小RNA(m icroRNAs,m iRNAs)是一类22个核苷酸左右的非编码调控RNAs,它可以通过切割mRNA或者是抑制翻译两种机制,在转录后水平发挥调控动植物生长发育的重要作用。最近,大量有关文献证实,哺乳动物中m iRNAs可能调控了大量的靶基因,从而影响多种生物学功能。许多从小鼠骨髓细胞中克隆而来的m iRNAs,在各种造血细胞系中受到不同的调控,而其中一些m iRNAs与白血病等造血系统恶性肿瘤有关。