宋内志贺氏菌I相大质粒的定向改造和透动转移

本文通过全细胞PCR克隆了宋内志贺氏菌侵袭性I相大质粒上的virG基因的部分片段（virG),并用天冬氨酸半醛脱氢酶基因（asd)取代了virG的中间部分,随之插入自杀性诱动质粒pXL275中,获得重组质粒pKNVA1。通过细菌间交配和体内同源重组,pKNVA1整合至I想大质粒中,在另一温度敏感的结合转移质粒pTH10的帮助下,共整合质粒被诱动转移至福氏志贺氏菌FWL01和大肠杆菌X6097中,并通过氯霉素富集和蔗糖反选择使自杀质粒pKNVA1从大质粒上脱落下来,玻片凝集试验和大质粒电泳图谱证实了宋内I相大质粒的成功诱动转移,表明这是一种定向转移大质粒行之有效的方法。     

弗氏志贺菌2aT32株asd基因缺失突变体的构建

目的：构建痢疾弗氏志贺菌２ａＴ３２的ａｓｄ基因全缺失突变体。方法；采用全菌Ｐ座痢疾弗氏２ａ Ｔ３２株染色体扩增了ａｓｄ基因及其上下游各约５００ｂｐ的染色体例 ＤＮＡ序列，并将其克隆至ｐＵＣ１８，测定其核苷酸序列，在体外用ｃｔｘＢ基因置换了ａｓｄ基因，然后将其克隆至自杀载体ｐＸＬ２７５。通过细菌酱和人同源重组，用ｃｔｘＢ基因完全取代痢疾弗氏２ａ Ｔ３２株染色体上的ａｓｄ基因。结果与结论：构建成ａｓｄ     

表达CtxB的非抗生素标记载体的构建

目的 构建用于表达CtxB的非抗生素基因作为选择标记的载体。方法 用PCR从质粒pMT999中,扩增获得2．9kb的汞抗性基因,与pBR322的复制起始区（ori)相连,得到重组质粒pBRH02。然后将含有β-内酰胺酶启动子的CtxB基因插入pBRH02中,构建表达质粒pBRC09。结果 pBRC09经转化大肠杆菌、痢疾杆菌,用GM1－ELISA均检测到CtxB在上述菌株中的有效表达。结论 利用汞抗性基因和pBR322的复制起始区,成功地构建成以非抗生素为选择标记的表达CtxB的重组质粒。     

细菌蛋白质组双向电泳中"串联珠"现象初探

目的 初步探讨细菌样品双向电泳中"串联珠"状蛋白点产生的原因.方法 通过对比不同样品制备方法对双向电泳胶图的影响,分析"串联珠"状蛋白点出现的条件,并取"串联珠"状蛋白点进行胶内酶解及MALDI-TOF/TOF分析,寻找"串联珠"状蛋白点可能产生的原因.结果 以含0.5% SDS的裂解液煮沸菌体的方法制备样品,就会产生"串联珠"状蛋白点.蛋白鉴定结果显示"串联珠"状蛋白点为同一蛋白,MALDI-TOF/TOF一级质谱峰没有出现明显的偏移峰.结论 "串联珠"产生的原因是由于SDS在加热条件下会对蛋白产生修饰或紧密结合作用,特别是相对分子质量较大的酸性蛋白.     

弗氏志贺菌ΔlysA突变株的构建及SILAC技术的应用尝试

目的构建弗氏2a志贺菌301株赖氨酸营养缺陷型突变株,为将细胞培养条件下稳定同位素标记(SILAC)技术应用于志贺菌蛋白质组学研究奠定基础。方法采用λ-Red重组系统对弗氏2a志贺菌301株lysA基因进行缺失,对野生株和突变株进行基本的表型测评和毒力评价,并利用双向电泳技术比较二者在全菌蛋白表达谱上的差异,最后将突变株分别在含有12C6-赖氨酸和13C6-赖氨酸的培养基中培养,根据双向电泳胶图取对应蛋白点进行胶内酶切及MALDI-TOF/TOF分析。结果成功构建了301 lysA基因缺失突变株,蛋白鉴定结果显示所取对应蛋白点为同一蛋白,在质谱图上轻重同位素峰位移为6 amu。结论本研究所构建的赖氨酸营养缺陷型突变株适合进行SILAC分析。     

利用免疫蛋白质组学鉴定炭疽杆菌蛋白MetK及其免疫原性验证

目的验证免疫蛋白质组中鉴定到的S-腺苷甲硫氨酸MetK蛋白的免疫原性。方法免疫蛋白质组学的方法鉴定到MetK蛋白,通过PCR方法扩增metK基因全长,然后将其克隆到原核表达载体pET32a中,转化大肠杆菌DH5α,测序正确后提取质粒转入BL21（DE3）中进行诱导表达。再通过Ni-NTA柱纯化MetK蛋白,纯化后的蛋白免疫SPF级的BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,通过多克隆抗体与炭疽芽孢杆菌A16R全菌蛋白Western印迹检测,验证MetK蛋白的免疫原性。结果与结论成功表达了MetK蛋白,制备了其多克隆抗体,为免疫蛋白质组学鉴定到的蛋白点进行验证,也为研究MetK蛋白的生物学功能研究提供了条件。