人乳头状瘤病毒16型不同基因疫苗联合免疫的实验研究

目的 探索联合免疫策略在预防和治疗人乳头状瘤病毒16型（HPV16）相关肿瘤中的作用。方法 在C57BL／6动物模型中，观察了表达HPV16基因的融合蛋白L2E7疫苗和重组痘苗病毒mE67疫苗的不同联合免疫方式在预防和治疗HPV16相关肿瘤中的作用。用酶联免疫斑点（ELISPOT）和细胞毒T淋巴细胞（CTL）反应评价它们在诱发机体产生细胞免疫应答中的作用。结果 我们发现以HPV16 L2E7融合蛋白＋佐剂（CpG）初免，用重组痘苗病毒rVVmE67加强免疫的联合免疫方式在C57BL／6小鼠实验中可以有效预防和治疗HPV16相关肿瘤的攻击。ELISPOT可以检测到高水平的E749-57肽特异性，分泌IFN-γ的效应T细胞。CTL检测同样反应出这种联合免疫方式所诱发的CTL细胞可以有效识别并杀伤含HPV16E6／E7的靶细胞。结论 以HPV16L2E7融合蛋白＋CpG初免，用重组痘苗病毒rVVmE67加强的联合免疫策略可以有效防治HPV16相关肿瘤，为进一步研究提供了科学基础。     

基于CRISPR-Cas9的痘苗病毒高效重组体系的建立

目的:利用规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)-CRISPR相关蛋白9(CRISPR associated protein 9,Cas9)技术对痘苗病毒(vaccinia virus, VACV)胸...     

新型冠状病毒抗体检测结果的标准化和平行比较北大核心CSCD

目的通过世界卫生组织(world health organization,WHO)新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)抗体国际标准品(international standard,IS)(G样本)、抗体参考盘(样本E、F、H、I、J)的应用降低SARS-CoV-2抗体检测结果差异、提高检测结果一致性。方法利用基于SARS-CoV-2活病毒的微量中和试验、假病毒中和试验以及商品化的ELISA试剂盒对WHO的SARS-CoV-2抗体IS和参考盘等共10个样本(A~J)分别进行检测,对检测结果进行分析比较。结果以IS为参考品确定其他样本的相对浓度,降低了检测结果之间的差异。假病毒中和试验、ELISA检测血清抗体参考盘结果与基于SARS-CoV-2 HB02株的中和试验基本一致,个别试剂可检测弱阳性样本。结论SARS-CoV-2抗体IS的使用促进了血清学检测方法的标准化,抗体参考盘适用于基于SARS-CoV-2原型株的所有检测方法,假病毒中和试验、ELISA等在一定程度上可作为活病毒中和试验的替代方法。     

非复制型痘苗病毒天坛株NTV诱发早期细胞凋亡

目的:对非复制型痘苗病毒NTV感染人源细胞后的细胞形态变化及相关分子机制进行研究,为NTV载体的进一步优化改造和应用提供科学依据。方法:用复制型痘苗病毒天坛株VTT和非复制型痘苗病毒NTV感染HeLa细胞,观察细胞的形态学变化。然后收获细胞,电泳检测rRNA断裂水平和Western blot检测凋亡相关分子信号,初步确...     

表达HPV18E7E6的重组痘苗病毒构建及免疫效果的初步研究

目的 构建表达HPV18E7E6融合蛋白的重组痘苗病毒,并对E7E6蛋白的免疫原性进行研究.方法 将去除了转化活性的HPV18E6、E7基因融合,插入痘苗病毒重组质粒,通过同源重组构建表达HPV18E7E6的重组痘苗病毒,观察其免疫效果.结果 构建了表达E7E6融合蛋白的重组痘苗病毒,PCR鉴定及测序表明融合基因序列与设计相符,正确插入到痘苗病毒TK区域;Western-Blot检测表明该重组病毒能表达HPV18E7E6融合蛋白.免疫后的小鼠可产生E6、E7特异性抗体,但ELISPOT没检测到E7肽库刺激小鼠脾细胞产生分泌IFN-丫的阳性反应.结论 构建了一株表达HPV18E7E6融合蛋白的重组痘苗病毒,可以有效诱发小鼠产生针对E6、E7的体液免疫,但不能诱发产生相应的细胞免疫,为进一步研究不同动物模型中HPV18E6E7的细胞免疫特点提供了实验基础.     

HPV16E7E6重组腺病毒的构建及免疫效果评价

目的 构建用于宫颈癌治疗的HPV16E7E6重组腺病毒并评价其免疫效果.方法 根据哺乳细胞使用密码子的偏嗜性设计HPV16E7E6融合蛋白表达优势密码子基因序列并合成.将合成的E7E6基因插入腺病毒重组穿棱质粒pCD316后,与Ad5腺病毒骨架质粒共转染293细胞,重组病毒经单斑纯化并进行目的基因插入及表达的鉴定.扩增纯化重组病毒后免疫小鼠,评价其免疫活性.结果 PCR试验证明E7E6密码子优化基因成功插入Ad5病毒;Western blot检测结果表明重组腺病毒中E7E6优化基因能高效表达,该重组腺病毒免疫C57小鼠后,可诱发强特异性T细胞免疫应答,在小鼠体内能完全抑制5×104 TC-1移植瘤细胞的生长.结论 重组HPV16E7E6腺病毒可作为治疗HPV慢性感染或宫颈癌的候选疫苗.     

The expression and preliminary evaluation of HPV6bL2△N360E7E6 fusion protein in E.coli for genital warts

Objective To express HPV6bL2△N360E7E6 fusion protein in E.coli and preliminarily evaluate its immune effect.Methods Three HPV6b gene fragments,which were L2(1-360 bp),E7 and E6,were fused by overlapping PCR,then were inserted into a prokaryotic expression vector and expressed in E.coli.C57BL/6 mice were immunized with purified fusion protein plus Al(OH)3 and/or CpG adjuvants through intramuscular route,the cellular and humoral immune responses were detected by IFN-γ ELISPOT and ELISA respectively.Results Protein plus CpG adjuvant could induce the strongest cellular immune response to E7 and E6,high antibody titer against L2 could be detected in all immunized groups but there were no significant difference among these groups.Conclutions HPV6bL2△N360E7E6 gene was successfully cloned into pQE30 vector and expressed in E.coli,the fusion protein was also purified and proved that could induce strong cellular and humoral immune responses with appropriate adjuvant in C57 BL/ 6 mice and could be used for future research.     

共表达HPV16L1、L2、E6、E7蛋白的重组非复制型痘苗病毒构建及鉴定

目的构建共表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1、L2、E6、E7蛋白的非复制型重组痘苗病毒人用疫苗株。方法以痘苗病毒为载体、利用同源重组技术筛选共表达HPV16L1、L2、E6、E7蛋白的重组痘苗病毒并对其进行鉴定。结果该病毒在CEF细胞上连续传至第15代,经斑点杂交结果表明重组病毒基因组中有L1、L2、E6、E7基因插入;经WesternBlot检测,重组病毒能稳定表达HPV16L1、L2、E6、E7蛋白。结论非复制型重组痘苗病毒NTVJE6E7CKL1L2可作为预防和治疗HPV16相关肿瘤及其癌前病变候选疫苗。     

表达HPV 16型结构蛋白的非复制型重组痘苗病毒的构建与鉴定

目的 构建表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)结构蛋白的非复制型重组痘苗病毒人用疫苗株。方法 采用聚合酶链反应技术(PCR)扩增并克隆HPV16主要结构蛋白L1和次要结构蛋白L2基因;将经过结构修饰的L1和L2基因插入痘苗病毒表达载体,通过与痘苗病毒在宿主细胞中同源重组后,筛选共表达L1／L2蛋白的重组痘苗病毒并对其进行鉴定。结果 DNA序列分析证实PCR扩增所获L1和L2克隆基因是正确的;斑点杂交结果表明重组病毒基因组中有L1和L2基因插入;该重组病毒在人源细胞中不复制或低水平复制,但可稳定表达相对分子质量为57000的L1蛋白和相对分子质量为90000的L2蛋白。结论 获得1株稳定表达HPV16 L1／L2蛋白的非复制型重组痘苗病毒人用疫苗株。     

表达HPV-16结构蛋白的重组痘苗病毒疫苗免疫效果研究

目的研究表达HPV—16结构蛋白L1和12的重组痘苗病毒（rVVL1L2）的免疫效果。方法以重组痘苗病毒rVVL1L2免疫C57BIJ6小鼠，用酶联免疫（ELISA）和酶联免疫斑点（ELISPOT）方法检测重组痘苗病毒诱发小鼠产生的体液免疫和细胞免疫应答水平；利用C3肿瘤细胞在C57BIJ6小鼠中的成瘤模型，观察重组痘苗病毒在抗肿瘤移植实验和肿瘤生长抑制实验中对小鼠的免疫保护效果。结果重组痘苗病毒rVVL1L2免疫的小鼠，可以检测到针对L1和12特异的抗体、L1165-175肽特异性的、分泌IFN-的T细胞；同时可以观察到免疫后的C57BI/6小鼠，可以有效预防HPV．16相关肿瘤细胞（1．5×10^5C3细胞）的攻击；对已产生的肿瘤，可以延缓肿瘤细胞的生长速度。结论重组痘苗病毒rVVL1L2可以有效诱发小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答，为研究预防和治疗HPV-16感染的疫苗提供了实验资料。