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目的利用基因工程技术制备铜绿假单胞菌外毒素A(PE),为深入研究PE的致病机理和免疫防治奠定基础。方法应用PCR技术从铜绿假单胞菌基因组中扩增外毒素A全长结构基因,将其克降于原核表达载体pQE-31中,所构建的重组质粒经测序鉴定后转化大肠埃希菌JM109, IPTG诱导表达;制备融合蛋白包涵体,并采用Ni-NTA柱亲和层析、葡聚糖凝胶过滤和阴离子交换层析分离和纯化目的蛋白;采用透析法对纯化后的目的蛋白进行复性,MTT法测定复性后的重组PE对L929细胞、B16黑素瘤细胞的细胞毒活性。结果通过对PCR反应体系的优化,扩增到了PE全长结构基因。所构建的pQE-PE重组质粒经酶切及测序鉴定与设计序列一致;转化E.coli JM109后,IPTG诱导目的蛋白表达率约为25%;SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(M_r)约为66×10~3,与理论预期值一致;破菌后电泳证实目的蛋白主要以包涵体形式表达。经亲和层析、葡聚糖凝胶过滤和阴离子交换层析后蛋白纯度大于95%。MTT法测得重组PE对L929细胞和B16黑素瘤细胞的半数抑制浓度(IC_(50)值)分别为2.13μg/ml、2.58μg/ml。结论通过对PE的表达纯化,获得了具有细胞毒活性的重组PE,为利用基因工程手段大量制备PE的工作奠定了基础。 相似文献
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肽抗生素hPAB-β在毕赤酵母中的表达与活性鉴定 总被引:5,自引:5,他引:0
目的 构建表达人源肽抗生素hPAB-β的重组毕赤酵母,为大量制备hPAB-β奠定基础.方法 用PCR及引物延伸法得到天然及优化的hPAB-β序列,克隆入pPIC9K质粒,转化DH5α大肠埃希菌,用酶切和核苷酸测序鉴定.重组质粒经SalⅠ酶线性化,整合入毕赤酵母GS115中,在DNA,mRNA及蛋白水平鉴定阳性重组子.结果 构建的含天然及优化序列的重组质粒酶切均可得到相应大小的插入片段,与预期相符,测序结果表明序列和阅读框均正确.线性化的重组质粒转入GS115后,得到7个不同的高拷贝阳性转化子,均能表达重组肽并具有良好的抑菌活性.结论 本研究成功构建含天然及优化hPAB-β序列的重组毕赤酵母工程菌,能够用于肽抗生素hPAB-β的制备. 相似文献
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奇异变形杆菌潜生体与繁殖体的耐药性差异及其机制探讨 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:观察奇异变形杆菌潜生体与繁殖体的耐药性差异并探讨其发生机制。方法:采用一株自已构建的标准产酶菌株和一株临床分离菌株、经波动培养法诱导产生潜生体及繁殖体,检测二者的耐药性差异,并通过β-内酰胺酶活性分析、外膜通透率测定及外膜蛋白SDS-PAGE检测来探讨其发生机制。结果:潜生体的耐药程度普遍高于繁殖体,二者的β-内酰胺酶活性差异不显著(P〉0.05),潜生体外膜通透率降低且有多种外膜蛋白减少或 相似文献
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目的构建伤寒沙门菌BcfD基因的原核表达质粒,表达BcfD蛋白。方法PCR法从伤寒沙门菌Ty2菌株基因组中扩增bcfD目的基因,经克隆和亚克隆构建原核表达载体pET-30a-bcf,将该重组质粒转化E.coliBL21(DE3)并进行原核表达,用SDS-PAGE和免疫印迹分析表达蛋白。结果扩增到与bcfD基因预期大小相符的片段,测序证明与bcfD基因序列完全一致,SDS-PAGE显示该蛋白主要以包涵体的形式表达,相对分子质量为42×103,免疫印迹分析表明,表达产物与经用大肠杆菌吸附处理后的伤寒患者血清能进行免疫反应。结论成功构建了bcfD基因原核表达载体并在大肠杆菌中表达了目的蛋白。 相似文献
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目的 构建pQE-HSV-1 UL15 exon Ⅱ原核表达载体,在大肠埃希菌中高效表达并免疫家兔制备抗体.方法 以HSV-1感染后的Vero细胞总RNA为模板,通过RT-PCR扩增HSV-1 UL15 exon-Ⅱ基因,克隆入原核表达载体pQE-31;重组质粒经酶切、测序鉴定无误后转化大肠埃希菌JM109,IPTG诱导表达;SDS-PAGE检测蛋白表达情况;表达蛋白用Ni-NTA亲和层析纯化及透析复性处理后免疫家兔制备特异性抗体,抗体的免疫原性用Western blotting进行检测.结果 通过RT-PCR扩增获得了HSV-1 UL15 exon-Ⅱ全长基因;构建的pOE-HSV-1 UL15 exon Ⅱ重组质粒经酶切及测序鉴定无误;阳性转化菌株经WIG诱导后SDS-PAGE电泳显示表达蛋白的相对分子质量约为43 000,与理论值一致,蛋白表达率约为35%~40%;表达蛋白经纯化及透析复性后免疫家兔获得的抗血清经Western blotting鉴定具有较好的特异性和敏感性.结论 成功构建了pQE-HSV-1 UL15 exon Ⅱ原核表达载体,诱导蛋白表达并进一步用表达的蛋白制备了特异性抗体,为HSV-1末端酶全长基因表达情况的鉴定及最终构建抗病毒组装药物的分子筛选模型奠定了前期实验基础. 相似文献
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细菌胞外糖染色显微镜检测技术 总被引:11,自引:0,他引:11
目的 建立细菌胞外糖显微镜常规检测方法,确定胞外糖作为细菌定值和致病因素的实验依据。方法 采用pH2.5的阿利新蓝水溶液与刚果红水溶液联合地细菌胞外糖染色,以不产生胞外糖的枯草芽胞杆菌作为阴性对照,及以Costerton的细菌胞外糖透身电镜观察法作为阳性对照。结果 细菌细胞呈淡红色,胞外糖为深红色,背景呈蓝色。结论 该方法简便易行,结果可靠,重复性好。比Costerton的方法经济,更易推广。 相似文献
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优化医学微生物学实验课程教学内容,改进教学方法和手段,充分利用现代教育技术,激发学生的学习兴趣,是提高教学质量的关键.鼓励学生独立操作、重视实验错误、正确分析实验结果是培养其独立思考、创新能力的重要环节. 相似文献
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利用IVIAT技术初步筛选伤寒沙门菌的体内诱导基因 总被引:4,自引:0,他引:4
目的 利用体内诱生抗原筛选技术初步筛选伤寒沙门菌的体内诱导基因.方法 首先将3个伤寒病人恢复期的血清等体积混合,用体外培养的伤寒沙门菌全菌体、超声裂解产物及加热变性裂解产物充分吸收处理.然后采用pET-30a/b/c表达载体系统构建伤寒沙门菌Ty2菌株的基因组表达文库,并以吸收后的血清为探针,筛选伤寒沙门菌基因组表达文库.结果 从5 000个克隆中获得5个阳性克隆,对阳性克隆测序和序列检索分析表明,涉及 6 个开放阅读框.结论 本实验利用IVIAT筛选体内诱导基因的各个程序是正确的,并初步筛选到伤寒沙门菌的体内诱导基因. 相似文献