GRIM-19基因表达及沉默对宫颈癌细胞株SiHa细胞中核转录因子STAT3表达的影响

目的:构建pEGFP-C2-GRIM-19真核表达载体并设计GRIM-19siRNA干扰序列,以探讨GRIM-19表达水平的变化对SiHa细胞中核转录因子STAT3表达的影响。方法:用RT-PCR法从SiHa细胞中扩增出带HindⅢ、BamHI酶切位点的GRIM-19基因片段,将GRIM-19基因片段克隆到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因真核表达载体pEGFP-C2上。分别将pEGFP-C2-GRIM-19及GRIM-19siRNA通过脂质体转染入SiHa细胞48h后,通过Western-blot检测GRIM-19、STAT3的表达。结果:成功构建pEGFP-C2-GRIM-19真核表达载体,转染后可见GFP表达及STAT3表达降低,转染GRIM-19siRNA后可见GRIM-19表达降低及STAT3表达升高。结论:在宫颈癌细胞株中GRIM-19具有调控STAT3表达水平的作用。     

GRIM-19及其截断体原核表达载体的构建及表达与纯化

目的构建GRIM-19及其截断体原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达并纯化融合蛋白。方法用RT-PCR法从HeLa细胞中扩增出带BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的GRIM-19及其截断体基因片段,将GRIM-19及其截断体基因片段克隆到pGEX-4T-3原核表达载体上,在大肠杆菌中诱导表达GST-GRIM-19及其截断体融合蛋白,用Glutathione Sepharose 4B纯化,纯化后蛋白经Western-blot鉴定。结果 pGEX-4T-3-GRIM-19及其截断体原核表达载体构建正确,并在大肠杆菌中成功诱导表达,IPTG诱导以浓度0.5mM,时间2h为宜,且通过Glutathione Sepharose4B成功纯化到融合蛋白。结论成功构建GRIM-19及其截断体原核表达载体,诱导表达并纯化GST-GRIM-19及其截断体融合蛋白。     

氯硝西泮治疗脑卒中情感性障碍30例疗效观察

氯硝西泮治疗脑卒中情感性障碍３０例疗效观察王青元，张琼香，邱晓光１９９１年以来，我们对住院的脑卒中病人中伴有情感性障碍症状者，给予氯硝西泮治疗，取得一定疗效，报道如下。病例选择在住院确诊的脑卒中病人中．选择伴有明显情感性障碍症状者，排除心、肺、肝、肾...     

HPV18E6原核表达载体的构建及3×flag-HPV18E6融合蛋白的诱导表达

目的 构建pET-22b-3×flag-HPV18E6原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白.方法 用RT-PCR法从HeLa细胞中扩增出带HindⅢ、SalⅠ酶切位点的HPV18E6基因片段,将HPV18E6基因片段克隆到p3×flag-myc-CMV-24载体上.然后设计特异性引物扩增3×flag-HPV18...     

人乳头瘤病毒18型E6蛋白真核表达载体的构建及其在子宫颈癌细胞株Hela细胞中的表达

目的构建并鉴定p3×flag-myc-CMV-24-HPV18E6真核表达载体,并转染Hela细胞后,检测其在Hela细胞中的表达。方法用RT-PCR法从Hela细胞中扩增出带HindⅢ、SalⅠ酶切位点的HPV18E6基因片段,将HPV18E6基因片段连接到pMD-18T载体上,通过限制性内切酶HindⅢ、SalⅠ酶切,T4连接酶连接到含有上述酶切位点的p3×flag-myc-CMV-24真核表达载体上,通过脂质体将p3×flag-myc-CMV-24-HPV18E6转染入Hela细胞48h后,Western-blot检测HPV18E6及3×flag表达情况。结果p3×flag-myc-CMV-24-HPV18E6真核表达载体构建成功,构建的真核表达载体可以被限制性内切酶HindⅢ、SalⅠ切开,电泳可显示相应条带,经测序其序列与设计的一致,转染到Hela细胞48h后经Western-blot检测可见HPV18E6的高表达及flag的表达。结论p3×flag-myc-CMV-24HPV18E6真核表达载体的成功构建为进一步研究HPV18E6的致癌机制奠定了基础。     

HPV16E6真核表达载体的构建及其在Caski细胞中的表达

目的构建p3×flag-myc-CMV-24-HPV16E6真核表达载体,转染Caski细胞,检测其在Caski细胞中的表达。方法用RT-PCR法从CaSki细胞中扩增出带HindⅢ、XbalⅠ酶切位点的HPV16E6基因片段,将HPV16E6基因全长片段克隆到真核表达载体p3×flag-myc-CMV-24上,通过脂质体将p3×flag-myc-CMV-24-HPV16E6转染入Caski细胞。结果构建的p3×flag-myc-CMV-24-HPV16E6的真核表达载体转染Caski细胞48h后经Western-blot可检测到融合蛋白高表达。结论成功构建了p3×flag-myc-CMV-24-HPV16E6真核表达载体;为进一步研究HPV16E6导致子宫颈癌病变的机制奠定了基础。     

高危型HPV16 E6蛋白表达抑制宫颈癌细胞株p63α表达的研究

目的:探讨高危型HPV16 E6蛋白的表达对宫颈癌细胞株中p63α表达的影响。方法:用RT-PCR法从SiHa中扩增出带酶切位点的HPV16 E6的片段,将HPV16 E6基因片段克隆到p3×flag-CMV-Myc-24真核表达载体上,通过脂质体转染入宫颈癌细胞株后,W estern blot检测p63α的表达。结果:成功构建HPV16 E6真核表达载体,转染至宫颈癌SiHa和Caski细胞株中,p63α均低于对照组。结论:高危型HPV E6能够抑制p63α的表达,提示p63α与HPV E6的相互作用在子宫颈癌发病中发挥重要作用。     

TAp63γ抑制宫颈癌细胞株SiHa端粒酶活性及对细胞生长动力学的影响

目的:探讨TAp63γ的表达对宫颈癌细胞端粒酶活性及生长动力学的影响。方法:通过瞬时转染TAp63γ真核表达载体提高SiHa细胞中TAp63γ的表达水平并经RT-PCR及Western blot验证;通过PCR-ELISA试剂盒检测细胞的端粒酶活性,通过MTT检测细胞增殖及对顺铂的敏感性,通过衰老相关β-半乳糖苷酶染色法检测衰老细胞。结果:与对照组相比,转染TAp63γ的SiHa细胞中端粒酶活性显著下降,差异有统计学意义(P<0.05);细胞增殖减慢,差异有统计学意义(P<0.05);对顺铂敏感性增强,差异有统计学意义(P<0.05);对照组细胞衰老比例为(8±1.5)%;而转染TAp63γ组的衰老细胞比例为(39±8.6)%,明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:TAp63γ具有抑制宫颈癌细胞端粒酶活性的作用,可能是针对宫颈癌细胞生长动力学治疗的新靶点基因。