无需凿开乳突的人工耳蜗植入方法：经外耳道电极植入技术

人工耳蜗植入时,传统的电极插入法需要经过保留外耳道后壁的乳突切开术、后鼓室切开术和耳蜗切开术。此方法由于技术成熟、稳定而在全世界广泛应用,但存在损伤面神经的风险。     

自杀基因质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV.TK在鼻咽癌细胞中的构建及转染研究

目的 构建含TK自杀基因的质粒表达载体并进行转染研究。方法 根据已发表的Hsv-TK基因的核苷酸序列，设计并合成一对引物，以含TK基因的PGEM/TK质粒为模板扩增出TK基因全长CDS序列，将其克隆到质粒表达载体pcDNA3．1(-)CMV中，进行序列分析和酶切鉴定后，运用电穿孔法将重组体pCDNA3．1(-)CMV-CD车专人鼻咽癌CNE-2细胞中，观察其表达情况以及无毒前体药物GCV干预下对CNE-2细胞生长的抑制作用。结果 酶切和序列分析证明pcDNA3．1(-)(2MV．TK含完整的TK基因序列，RT-PCR从转染细胞总RNA中扩出预期片段；鼻咽癌CNE-2细胞在无毒前体药物GCV干预下，其生长受到抑制。结论 成功构建了质粒载体pcDNA3．1(-)CMVTK，可以将其作为鼻咽癌自杀基因治疗的一种载体。     

microRNA抑制鼻咽癌hTERT基因表达的实验研究

目的观察microRNA对鼻咽癌CNE-2细胞hTERT基因表达的调控效应，探讨microRNA在鼻咽癌基因治疗的应用前景。方法构建靶向hTERT基因的microRNA表达质粒，脂质体法转染鼻咽癌CNE-2细胞，RT-PCR检测转染细胞中hTERT基因的mRNA水平，Western Blotting观察microRNA对hTERT蛋白表达水平的调控效应，CCK-8比色法检测microRNA对细胞生长的抑制作用，流式细胞学检测miRNA诱导细胞凋亡的作用。结果在mcroiRNA表达质粒转染CNE-2细胞后，hTERT的mRNA表达水平下调，蛋白表达水平降低，细胞周期在G0～G1期受阻，并诱导细胞凋亡。结论microRNA可在鼻咽癌中有效下调hTERT基因的表达水平，抑制鼻咽癌细胞增殖并诱导其凋亡，为鼻咽癌基因治疗研究奠定了一定的基础。     

靶向hTERT基因的microRNA前体质粒抑制鼻咽癌细胞生长的体内实验研究

目的 构建并筛选靶向人端粒酶逆转录酶基因的microRNA前体(pre-microRNA)质粒,通过体内实验验证该质粒对鼻咽癌CNE-2细胞生长的抑制作用.方法 设计3对针对hTERT基因不同位点的pre-microRNA(茎环结构的前体)片段,构建携带比序列的真核表达质粒(pre-miR-Htert1-3)并测序鉴定.脂质体法瞬时转染重组质粒到鼻咽癌CNE-2细胞,采用pre-time RT-PCR筛选出对hTERT基因表达抑制作用最强的质粒;在稳定转染的CNE-2细胞中,用软琼脂集落形成实验和Western blot进一步确认该质粒作用;在裸鼠体内实验中,观察肿瘤生长情况,并以免疫组化检测肿瘤中hTERT的表达.结果 重组质粒经测序证实构建成功.与PBS组相比,3种质粒分别使hTERT基因mRNA水平下降77.3%、15.1%和9.5%;筛先的出pre-miR-Htert1在稳定转染的CNE-2细胞中,使细胞hTERT蛋白下调、细胞集落形成能力下降;建立了人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,发现pre-miR-Htert1对裸鼠移植瘤生长抑制率为64.8%,并且使肿瘤内hTERT表达下降.结论 成功构建并筛选出靶向hTERT基因的pre-microRNA真核表达质粒,通过体外和体内实验证实,该质粒对鼻咽癌CNE-2细胞内的hTERT 基因表达具有明显抑制作用,并且有效抑制了肿瘤的生长.     

Fat1蛋白在下咽癌中的表达及在侵袭转移过程中的作用

摘要：目的探讨Fat1蛋白在下咽癌中的表达及其生物学行为。方法应用免疫组织化学染色检测组织中Fat1蛋白的表达水平,采用Kaplan Meier法分析Fat1蛋白的表达与下咽癌患者生存期的关系。siRNA干扰下咽癌Fadu细胞中Fat1蛋白的表达;Western blot 法检测siRNA干扰后Fat1蛋白的表达;CCK 8实验检测细胞增殖能力;克隆形成实验检测细胞成瘤能力;划痕实验、Transwell 小室实验检测其侵袭、迁移能力。结果Fat1蛋白主要在胞浆中表达,在下咽癌复发病例中的表达强度明显低于未复发患者（P=0.001）;低表达组患者总生存时间明显低于高表达组（P=0.001）。体外实验提示,siRNA下调Fat1蛋白后,Fadu细胞生长能力明显高于对照组（P=0.004）,且细胞克隆数也明显高于对照组（P=0.001）;此外,下调Fat1蛋白后,Fadu细胞的迁移能力高于对照组,且细胞穿越小室的细胞数明显高于对照组（P=0.000）。结论Fat1蛋白表达下调提示下咽癌患者预后较差;Fat1蛋白能显著抑制下咽癌细胞的生长、增殖、侵袭、转移能力。     

自杀基因质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV.CD的构建及进行喉癌Hep-2细胞株转染研究

目的:构建含酵母菌自杀基因CD的质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV.CD,并利用该载体进行喉癌Hep2细胞株转染研究,体外实验观察前体药物5FC对稳定表达CD基因的喉癌Hep2细胞株的杀伤作用。方法:通过RTPCR从酵母菌RNA内扩增出CD基因全长CDS序列,将其定向克隆到质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV中,重组体质粒经XhoI/HindⅢ双酶切鉴定,并对重组体中的CD基因片段进行序列分析,将鉴定好的阳性重组质粒pcDNA3.1(-)CMV.CD运用电穿孔法转入喉癌Hep2细胞中。经300～600mg/LG418正筛选14d和10mg/L前体药物5FC负筛选,获得稳定表达CD基因的喉癌Hep2细胞株,提取该细胞株细胞的总RNA,经RTPCR鉴定CD基因的表达。四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察不同浓度5FC对稳定表达CD基因的喉癌Hep2细胞及转染空白载体pcDNA3.1(-)CMV的对照组喉癌Hep2细胞的杀伤作用。结果:阳性重组质粒pcDNA3.1(-)CMV.CD经XhoI/HindⅢ双酶切后获得5353bp的片段及496bp的插入片段,DNA自动序列分析证明重组体质粒含完整的477bp长的CD基因CDS序列。RTPCR从转染细胞总RNA中扩出453bp的预期片段。当添加不同浓度的5FC时,表达CD基因的Hep2细胞不同程度地被杀死,而对照组的细胞几乎未受到影响,两组细胞的相对生存率差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:成功构建了质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV.CD,建立了稳定表达酵母菌CD基因的喉癌Hep2细胞株,表达CD基因的Hep2细胞可以被5FC杀死。     

hTERTp在鼻咽癌中放射敏感性的研究

目的观察放射干预对人端粒酶逆转录酶基因（hTERT）启动子启动活性以及鼻咽癌靶向调控的影响。方法利用基因重组技术构建pGL-3-hTERTp质粒以及pcDNA3．1．hTERT．CD／UPRT质粒,脂质体介导重组质粒pGL-3-hTERTp转染鼻咽癌CNE-2细胞以及人成纤维皮肤细胞（HDF）,并给予不同剂量放射干预,双荧光素酶活性分析其启动活性变化。pcDNA3．1．hTERT．CD／UPRT质粒转染鼻咽癌CNE-2细胞;运用RT-PCR以及免疫印迹法检测不同放射剂量下自杀基因表达。结果接受放射干预后,hTERT启动子活性明显增强,给予2、6、10Gy放射干预后,其启动活性分别增加了10倍、19倍和34倍,其差异有统计学意义（P〈0．01）。HDF组无论放射与否,其测量值与pGL-3Basic质粒无统计学差异（P〉0．05）。pcDNA3．1．hTERT．CD／UPRT质粒转染CNE-2细胞后,放射剂量增加至6、10Gy检测到目的基因表达。结论放射干预可提高hTERT启动子在鼻咽癌CNE-2细胞中的启动活性,且对其肿瘤特异性无影响。以放疗为主的肿瘤治疗中,hTERT启动子可能为潜在靶向性基因治疗的备选因子。     

CDglyTK融合自杀基因杀伤喉癌Hep-2细胞的体外实验研究

目的：研究融合自杀基因CDglyTK联合前体药物对喉癌Hep-2细胞的杀伤效应。方法：构建质粒表达载体pcDNA3．1（-）CMV．CDglyTK,XhoⅠ／HindⅢ酶切鉴定,测序分析CDglyTK基因序列。电穿孔法将重组质粒转染Hep-2细胞,400mg／LG418筛选14d获得稳定表达CDglyTK基因的Hep-2细胞,RT—PCR及Western-blotting鉴定CDglyTK基因的表达。以转染空白载体pcDNA3．1（-）的Hep-2细胞为对照,MTT法观察5-FC、GCV、5-FC加GCV对表达CDglyTK基因的Hep-2细胞生长的抑制作用。结果：酶切和基因测序分析证明重组质粒含完整的CD及TK基因,RT—PCR从转染细胞总RNA中扩出707bp的预期片段,Western-blotting检测到该基因表达的分子量为59000的蛋白。表达CDglyTK基因的Hep-2细胞在5-FC、GCV、5-FC加GCV干预下生长受到抑制,5-FC与GCV联合有更强的杀伤效应。结论：CDglyTK融合自杀基因可以成为基因治疗喉癌的有效方法。     

鼻内镜下儿童腺样体切除术的并发症及其预防

目的：探讨鼻内镜下儿童腺样体切除术出现的并发症及其预防方法。 方法：对215例腺样体肥大的患儿实行鼻内镜下腺样体切除术,术后随访1~6月。总结术中及术后出现的并发症及处理方法。结果：术后患儿临床症状消失或减轻,而并发症出现情况为：鼻出血10例,鼻腔粘连30例,腺样体术后增生1例。 结论：鼻内镜下腺样体切除术在直视下进行,视野清楚,操作方便,手术时间短。但术者仍需警惕可能出现的并发症,尽量加以避免。