谷氨酸脱羧酶65片段与IL－10双基因真核表达载体的构建与鉴定

 目的 优化以往构建的以预防 1 型糖尿病为目的的全长谷氨酸脱羧酶（GAD）65 DNA疫苗，尝试构建GAD 65片段与IL-10双基因真核表达载体。方法 从GAD65质粒中扩增出GAD190-315片段和GAD490-570片段的cDNA，以overlap PCR法将之分别与hIL-2信号肽cDNA拼接，得到SGAD190-315、SGAD490-570融合基因。以p43.2-mIL-10质粒为模板，用PCR方法扩增出IL-10基因。将SGAD190-315、SGAD490-570融合基因分别与IL-10基因依次克隆入双启动子真核表达载体pBudCE4.1中，构建出2种双基因重组真核表达载体pBud-SGAD190-315/IL-10和pBud-SGAD490-570/IL-10。2种重组真核表达载体经测序鉴定正确后，用脂质体介导的方法转染COS-7细胞，转染后48和72 h以蛋白质印迹法检测细胞裂解产物及上清液中SGAD190-315和SGAD490-570融合基因的表达，ELISA方法检测细胞上清液中IL-10的表达。结果　核酸序列测定表明克隆的SGAD190-315、SGAD490-570融合基因和IL-10基因序列与报告序列一致。蛋白质印迹法和ELISA方法均检测到SGAD190-315/IL-10和SGAD490-570/IL-10重组真核表达载体在COS-7细胞中的表达。结论　成功构建了2种GAD65片段与IL-10双基因真核表达载体，为1型糖尿病的基因疫苗预防研究提供了实验基础。     

谷氨酸脱羧酶抗体在临床初诊2型糖尿病病程中的演变

目的观察谷氨酸脱羧酶抗体(GADAb)在临床初诊2型糖尿病(T2DM)病程中的变化情况。方法在我院内分泌科连续入组病程1年以内的初诊T2DM患者共303例。每半年或1年复查GADAb,每年复查空腹C肽,每3个月检测糖化血红蛋白。随访1~6(中位数1·2)年。结果入组时GADAb阴性的265例患者随访2年内保持阴性不变;38例GADAb阳性,随访结束时16例转阴;5例表现为抗体阳性→阴性→阳性波动;17例始终保持抗体阳性。GADAb整体上随病程发展其滴度减低(P<0·05),且其变化仅与初始抗体滴度呈负相关(P<0·01)。结论GADAb在临床初诊T2DM病程中存在变化。单次检测GADAb有可能漏诊自身免疫性糖尿病。     

基于弥散张量成像的脑结构网络增龄性变化研究

目的基于弥散张量成像及纤维束追踪技术构建大脑结构网络,研究大脑结构网络增龄性变化。方法分别构建30例青年人和30例老年人的脑结构网络。运用图论分析方法,计算脑结构网络的全局以及局部网络拓扑参数,定量分析年龄对大脑网络全局特性及局部特性变化的影响。结果研究显示人脑结构网络具有小世界属性,脑网络全局特征参数与年龄具有强相关性(P<0.05),平均节点度、局部效率以及全局效率随年龄增长呈明显下降趋势,而平均聚类系数和平均最短路径长度呈上升趋势。脑网络局部特性与大脑全局特性的变化具有一致性,其中右侧楔前叶、左侧颞中回、双侧前扣带和旁扣带脑回、双侧内侧和旁扣带脑回、左侧梭状回、左侧舌回、左侧距状裂等脑区存在显著老化现象。结论大脑网络信息传输效率随年龄的增长而降低,整体机能随年龄增长呈下降趋势,但在局部脑区有着不同的老化机制。     

羧基肽酶-H抗体与LADA患者胰岛β细胞功能关系的横断面研究

目的：探讨羧基肽酶-H自身抗体（CPH—Ab）与成人隐匿性自身免疫性糖尿病（LADA）患者胰岛β细胞功能的关系,以进一步明确其对LADA的诊断价值。方法：选择临床初诊2型糖尿病（T2DM）患者545例,采用放射配体法检测血清CPH—Ab和谷氨酸脱羧酶抗体（GAD-Ab）滴度,以筛出的CPH-Ab阳性患者为病例组,以GAD—Ab阳性患者和抗体阴性的T2DM患者为对照组,比较3组研究对象的胰岛β细胞功能（以空腹和餐后2hC肽值表示）,分析CPH-Ab与成人隐匿性自身免疫性糖尿病（LADA）患者胰岛β细胞功能的关系。结果：CPH—Ab阳性患者的空腹C肽介于GAD-Ab阳性与两种抗体（GAD-Ab和CPH—Ab）均阴性的T2DM患者之间（P〈0.05）,以病程分层后三者的C肽值仍具有统计学意义（均P〈0．05）,而以BMI分层无明显差异（均P〉0．05）。经以年龄、起病年龄、病程、性别等为协变量校正后,3组间的空腹C肽和餐后2hC肽值仍存在显著性差异（均P〈0,001）,其中CPH—Ab^＋组仅空腹C肽低于Ab—T2DM组（P〈0,05）,而GAD—Ab^＋组空腹和餐后2hC肽均低于Ab^-T2DM组（P〈0．05和P〈0．01）。胰岛素缺乏患者在CPH-Ab^＋组、GAD-Ab^＋组和Ab—T2DM组的比例分别为27．6％（8／29）,48．1％（8／52）和13．5％（54／400）,三者间差异有统计学意义（P〈0.001）。多元线性逐步回归分析提示,GAD-Ab,BMI和空腹血糖对T2DM患者的空腹C肽和餐后2hC肽均有影响（均P〈0．05）,而CPH-Ab与二者均无统计学相关（均P〉0．05）。结论：CPH抗体对LADA患者胰岛β细胞功能的影响不如GAD-Ab显著,CPH-Ab对LADA患者胰岛功能衰减的作用需前瞻性研究。     

两种分泌型人谷氨酸脱羧酶65片段DNA疫苗的构建与鉴定

目的:构建和鉴定分泌型人谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)65片段DNA疫苗.方法:从人GAD65质粒中扩增出GAD190-315和GAD490-570两个片段的cDNA,分别与hIL-2信号肽cDNA基因拼接,将拼接后的片段克隆入pBudCE4.1真核表达载体,测序鉴定,并用Western印迹检测融合基因的表达.结果:核酸序列测定表明克隆的融合基因序列与报告序列一致,开放阅读框正确,Western印迹检测显示这两种人GAD65片段分泌表达.结论:两种分泌型人GAD65片段DNA疫苗均成功构建,为1型糖尿病的预防提供了实验基础.     

不同胰岛自身抗体阳性1型糖尿病临床特征分析

目的探讨单独或合并锌转运体8自身抗体(ZnT8A)、谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)及蛋白酪氨酸磷酸酶抗体(IA-2A)阳性患者的1型糖尿病(T1DM)患者临床特征。方法采用放射配体检测法检测中南大学湘雅二医院1999—2009年收治的539例T1DM患者的ZnT8A、GADA及IA-2A,并将其分成三个亚组进行比较。结果(1)单一ZnT8A阳性组较抗体阴性组病程更长,胰岛素用量更大,收缩压更低,合并代谢综合征比例更少。单一ZnT8A阳性组较单一GADA阳性组BMI、WHR及空腹C肽值更高(P<0.05),而糖化血红蛋白水平更低(P<0.05);(2)多个抗体阳性组起病年龄显著低于抗体阴性组(P<0.05);1个抗体阳性患者的空腹C肽及餐后2 h C肽显著低于抗体阴性组(P<0.05);3个抗体阳性患者较1个抗体阳性患者的起病年龄更小(P<0.01),BMI更低(P<0.05),病程更短(P<0.05)。(3)合并任意两种抗体阳性中"GADA阳性与IA-2A阳性"组餐后C肽最低(P<0.01),空腹C肽也较低,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论单独或合并ZnT8A,GADA及IA-2A的T1DM临床特征分析对临床具有重要的指导意义。     

体质指数对女性胫骨超声传导速度的影响

目的研究体质指数(BMI)对骨峰值期和绝经后女性的胫骨超声传导速度(SOS)的影响。方法采用骨定量超声仪测量399例骨峰值期和589例绝经后女性的胫骨SOS值,并按BMI不同各分为低体重组、正常体重组和肥胖组进行分析。结果骨峰值期,女性BMI与胫骨SOS无相关性(r=0.054,P=0.287),低体重组、正常体重组和肥胖组的胫骨SOS差异无显著性(F=0.2,P=0.801);绝经后,女性BMI与胫骨SOS呈正相关(r=0.115,P=0.006),肥胖组的胫骨SOS高于低体重组和正常体重组(F=4.2,P=0.016),且肥胖组和正常体重组骨质疏松症的患病率均低于低体重组(P<0.001)。结论女性骨峰值期,BMI对胫骨的强度影响小;绝经后,BMI大者能延缓胫骨的强度下降。     

谷氨酸脱羧酶抗体和蛋白酪氨酸磷酸酶抗体检测的标准化研究

目的研究谷氨酸脱羧酶抗体(GAD—Ab)和蛋白酪氨酸磷酸酶-2抗体(IA-2A)检测的标准化，为合理选择检测方法及准确判定结果提供依据。方法应用国际糖尿病免疫学会(IDS)推荐的WHO单位制，采用放射配体法检测125名健康人的GAD—Ab和IA-2A以确定阳性判断标准，通过检测IDS第3次糖尿病自身抗体标准化检测方法评估(DASP 2003)工作组提供的100名健康对照及50例新发1型糖尿病患者血清，验证其灵敏度与特异性。并采用新一代的ELISA试剂盒检测41例已知抗体滴度的标本，对比ELISA与标化后放射配体法的一致性。结果GAD—Ab的阳性阈值为18．5U／ml，IA-2A为2．7U／ml。DASP 2003反馈结果显示，本室GAD—Ab检测的灵敏度82％，特异性98％；IA-2A检测的灵敏度64％，特异性100％；受试者工作特征(ROC)曲线分析显示，本室GAD-Ab曲线下面积(AUC)以及统一按95％特异性标化后的灵敏度(AS95)分别为0．946％及86％，IA-2A分别为0．824％及68％。在52个回报结果的实验室中综合排名第15位。ELISA试剂盒与标化后的放射配体法检测GAD—Ab的一致率82．9％，Kappa值0．656；检测IA-2A的一致率75．6％，Kappa值0．514；结果判定不一致者多集中在阳性边缘水平的标本中。结论经标准化后的GAD—Ab和IA-2A放射配体法灵敏度和特异性明显提高；新一代ELISA试剂盒检测GAD—Ab和IA-2A可应用于临床，但对于检测结果阴性而临床可疑者，建议采用放射配体检测法核实。     

双能X线骨密度仪测量双侧前臂骨面积、骨矿含量和骨矿密度的比较

目的比较健康人优势和非优势前臂的骨面积（Ａｒｅａ）、骨矿含量（ＢＭＣ）和骨矿密度（ＢＭＤ）。方法采用双能Ｘ线骨密度仪测量５５例１６～７３岁（平均年龄５２岁）健康志愿者双侧前臂（优势臂均为右臂）的Ａｒｅａ、ＢＭＣ和ＢＭＤ。结果右前臂各部位Ａｒｅａ、ＢＭＣ显著高于左前臂（Ｐ＜０．００１和Ｐ＜０．０５）,除桡骨远端１／３段ＥＭＤ右前臂显著高于左前臂外（Ｐ＜０．０１）,其余部位ＢＭＤ左右侧无差别。结论优势臂的Ａｒｅａ和ＢＭＣ均高于非优势臂,而ＢＭＤ两者差别不大。