慢病毒介导干扰TM4SF1基因表达对血管内皮细胞体外生物学行为的影响

目的:探讨RNAi下调4跨膜区的L6超家族成员1(TM4SF1)基因表达对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的增殖、周期、迁移及血管生成的影响。方法:构建靶向沉默TM4SF1基因表达的慢病毒载体(LV-RNAi),感染高表达TM4SF1的HUVEC。实验分组:干扰组(LV-TM4SF1-RNAi)、阴性对照组(LV-CON-RNAi)、空白对照组(HUVEC),经流式细胞仪分选出稳定感染的细胞株。实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测细胞TM4SF1 mRNA表达水平;免疫荧光细胞化学及Western blot法检测蛋白定位及表达;CCK-8法检测细胞增殖能力;FCM检测细胞周期;Transwell小室检测细胞迁移能力;基质胶成管实验检测细胞血管生成能力。结果:成功构建的慢病毒载体高效稳定地感染了HUVEC。干扰组中TM4SF1 mRNA和蛋白表达明显低于阴性对照组和空白对照组,差异均有统计学意义(P0.05)。接种72h时,干扰组细胞的增殖能力(0.59±0.06)显著低于阴性对照组(0.94±0.04)和空白对照组(1.04±0.05),差异均有统计学意义(P0.05)。干扰组细胞G0/G1期的比例[(69.30±5.48)%]显著多于阴性对照组[(54.40±4.09)%]和空白对照组[(51.69±4.16)%],差异均有统计学意义(P0.05)。干扰组细胞的迁移能力、细胞成管能力均显著低于阴性对照组和空白对照组,差异均有统计学意义(P0.05)。结论:下调TM4SF1基因表达可使HUVEC的增殖、迁移及血管生成能力受抑制,有可能成为抗血管生成的一个潜在靶点。     

卵巢癌相关抗原TM4SF1 HLA-A2限制性CTL表位预测及鉴定

目的 预测并筛选免疫反应性较强的四跨膜蛋白超家族成员1（transmembrane 4 L6 family member 1,TM4SF1） 人类白细胞抗原A2（human leukocyte antigen A2,HLA-A2）限制性T淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte,CTL）表位肽。方法 联合4种软件（BIMAS、SYFPEITHI、IEDB、PROPRED I）对TM4SF1的 HLA-A2限制性CTL表位进行预测,并采用预培养法酶联免疫斑点法（enzyme-linked immunospot assy,ELISOPT）、直接法ELISOPT对所测得表位肽的免疫反应性进行鉴定。结果 4种不同软件共预测出10条表位多肽,对其中4条（P1、P2、P8、P10）进行免疫反应性验证。多肽活化CTL能力结果显示,预培养法ELISPOT产生斑点形成细胞（spvt forming cell,SFC）的净值T明显高于直接法ELISPOT：［（阳性对照肽：322±8 vs 169±22,P<0.05）、（多肽P1：114±10 vs 39±7,P<0.05）、（多肽 P10：156±31 vs 52±8,P<0.05）］。单个活化CTL细胞分泌INF-γ因子的水平检测结果显示,预培养法 ELISPOT 产生斑点的平均大小明显大于直接法 ELISPOT［（阳性对照肽：21.91±2.45 vs 13.80±1.76,P<0.05）、（多肽P1：12.90±0.88  vs 8.31±1.40,P<0.05）、（多肽P10：17.50±3.85 vs 11.96±0.61,P<0.05）］。表位多肽P1、P10均具有免疫原性,P10的免疫活性更高。结论 预培养法ELISPOT检测多肽的免疫反应性较直接法ELISPOT灵敏性更高,多种软件联合ELISPOT预培养法可有效筛选出免疫反应性更强的卵巢癌相关抗原TM4SF1 HLA-A2限制性CTL优势表位,其中P10的免疫活性最高。