操纵子重复克隆以提高外源基因的表达水平及同一大肠杆菌细胞内质粒DNA总量为一常数的新概念

目的　确定在一个表达质粒载体上串联目的操纵子以提高目的蛋白表达量的可行性 ,阐明宿主细胞对胞内质粒 DNA总量调控的可能机制。方法　亚克隆构建操纵子正向串联的表达载体 ;SDS凝胶电泳和激光扫描测定目的蛋白表达量 ;3H- Td R掺入法测定质粒拷贝数。结果　构建两组质粒 :CW11系列分别含 1～ 4个正向操纵子 ;CW12系列分别含 1～ 3个正向操纵子。在未诱导时 ,操纵子的串联不影响宿主大肠杆菌的生长 ;温度诱导表达后 ,CW11系列目的蛋白表达量分别为菌体总蛋白的 46 .0 %、5 4.8%、5 6 .1%和 6 0 .1% ,CW12系列目的蛋白表达量分别为菌体总蛋白的 33.5 %、44 .0 %和 47.1%。两组质粒的拷贝数均随操纵子串联个数的增加而减少 ,但目的基因的总剂量随之增加。实验数据同时表明 ,在相同的培养条件下 ,同一菌株每个宿主细胞内的质粒 DNA总量被限制在一定范围内。结论　操纵子串联增加了目的基因的剂量 ,从而提高了目的基因在大肠杆菌中的表达水平。另外 ,质粒大小和其拷贝数呈负相关 ,在同一培养条件下 ,对于特定的大肠杆菌菌株 ,宿主细胞内质粒 DNA总量在一定程度上是一个相对的被限定的常数。     

工程菌DH5α/pCW-PL-XE-TNFαm2的遗传稳定性

目的本基因工程大肠杆菌DH5α/pCW-PL-XE-TNFαm2所表达的靶向融合蛋白XE-TNFαm2已被初步证明具有用于清除艾滋病患者体内HIV病毒的前景。其目的蛋白表达水平为32%～36%细胞总蛋白。本研究旨在验证其遗传稳定性。方法工程菌株DH5α/pCW-PL-XE-TNFαm分别在LBAmp+与LBAmp-二种固体培养基上逐日单菌落划线传代,32℃培养过夜。每间隔十代运用一般温控表达技术,确定其XE-TNFαm2的蛋白含量,最后比较分析各代之间目的蛋白(20.3 kDa)表达水平的差异情况。结果该重组基因工程菌连续传100代后XE-TNFαm2的蛋白表达水平没有明显差异(P>0.05);只是在上述两种情况下传至100代后将其置于4℃保藏4、5、6个月,其目的蛋白表达水平有8%的下降。本载体质粒含有的CIts857序列、PL启动子与T1T2末端终止序列,是确保目的基因稳定高表达的3个关键元件。结论本研究结果证明该工程菌DH5α/pCW-PL-XE-TNFαm2具有良好的遗传稳定性。     

急性髓系白血病患者来源白血病干细胞的分选与鉴定

 目的　分选急性髓系白血病患者白血病干细胞并进行鉴定,为白血病干细胞的进一步研究奠定基础。方法　采用Ficoll密度梯度离心法从患者骨髓中分离单个核细胞。采用流式细胞术从单个核细胞中分选CD+34 CD+123白血病干细胞,通过集落形成能力和鹅卵石形成能力检测分选后白血病干细胞的自我更新与分化能力,同时检测CD+34 CD+123 细胞纯度,观察其细胞形态。结果　分选后的CD+34 CD+123 白血病干细胞比例占总分选细胞的10.7 %,具有集落形成能力和鹅卵石形成能力,CD+34 CD+123 细胞纯度为62.1 %。结论　成功分选与鉴定了白血病干细胞,可用于其后的进一步研究工作。     

基因工程产品心钠素的Tris—Tricine—SDS—PAGE电泳检测

传统的Tris-甘氨酸-SDS-PAGE电泳分析分辨大分子物质的相对分子质量范围在１００００～２０００００，因此，在对一些相对分子质量更小的多肽进行电泳染色分析时，即使采用银染法，也无染色条带显示。在获得纯化的心钠素（ANP）（相对分子质量为３０８０）后，对于鉴定分析心钠素的存在及其纯度，在实验中无论是用Tris-SDS-PAGE胶，还是Tris-Tricine-SDS-PAGE胶电泳检测纯化后的小分子多肽，采用常规的考马斯亮蓝R２５０染色法时，结果均不理想。通过实践，笔者建立了一套有效的鉴定小肽的电泳方法。本实验方法采用Tricine-SD…