EGFR和PD-L1双靶向嵌合抗原受体构建及表达

目的:构建肿瘤相关抗原表皮生长因子受体特异性嵌合抗原受体(EGFR-CAR)和程序性死亡受体-配体1(PD-L1)抗体双修饰慢病毒载体表达系统。方法:人PD-L1-Fc蛋白免疫BALB/c小鼠,经细胞融合、亚克隆筛选高分泌PD-L1特异性抗体的稳定杂交瘤,酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot检测抗体特异性,流式细胞术(FACS)鉴定对PD-1配受体封阻性能,Fortebio测定抗体亲和力,抗体全长测序,经保留鼠源CRD1、CRD2和CRD3人源化改造后构建单链抗体(single-chain variable fragment,scFv);人EGFR单克隆抗体杂交瘤系,经5′RACE技术扩增其轻链和重链可变区(VL和VH)基因,构建scFv,克隆至真核载体pcDNA3.1表达鉴定。基因合成EGFR-CAR(引入CD137协同信号胞内功能域)与PD-L1-scFv借助2A序列连接,克隆入慢病毒pLVX-EF1a-IRES-ZsGreen1表达载体,使用Lenti-X Packaging Single Shots (VSV-G)共同转染293T细胞,获得包装病毒,感染293V细胞,FACS测定CAR膜表达,ELISA检测CAR感染293V细胞培养上清中PD-L1-scFv表达情况,转染激活人外周血T细胞,验证CAR膜表达。结果:获得PD-L1抗体11E3,具备高度配受体封阻性能,经人源化改造后,亲和力稳定(2.67×10 -10 mol/L),EGFR-scFv获得有效表达。进一步构建了EGFR-CAR和PD-L1双修饰慢病毒分泌型CAR(CTC0537-1)及膜表达型CAR(CTC0537-2),其病毒感染293V细胞阳性率为10%。CTZ0431-1感染293V细胞后,细胞膜表面表达EGFR-scFv,检测培养上清存在PD-L1-ScFv;CTZ0431-2感染293V细胞后,细胞膜表面EGFR-scFv和PD-L1-scFv有效表达,双表达病毒感染活化T细胞的CAR表达率为39.3%。 结论:成功构建了EGFR-CAR和PD-L1-scFv双表达慢病毒载体,EGFR-CAR中度结合亲和力,此为EGFR靶向和PD-L1抗体双修饰CAR-T细胞的实体瘤治疗研究提供了关键工具。     

BCL10高表达引起脾脏边缘带B细胞抗凋亡而致其体内增生

目的以Eμ-BCL10转基因(transgenic,Tg)小鼠为模型研究BCL10高表达引起MALT淋巴瘤发病的分子机制。方法 PCR鉴定Eμ-BCL10转基因小鼠,Western blotting检测BCL10转基因蛋白的表达,组织学方法显示BCL10Tg小鼠脾脏MALT淋巴瘤的前体细胞-边缘带(marginalzone,MZ)B细胞扩增,流式细胞仪鉴定脾脏边缘带B细胞并分离出这群B细胞用于抗凋亡机制的研究,使用Annexin V-FITC/PI双染法经流式细胞仪检测边缘带B细胞凋亡情况。结果 PCR鉴定BCL10转基因阳性(Tg/+)小鼠,Western blotting证明内源性BCL10蛋白在Tg/+和非转基因野生型(widetype,WT)小鼠中表达的水平相同;BCL10Tg/+小鼠BCL10蛋白的表达量是WT小鼠的2倍。组织学染色显示,BCL10Tg/+小鼠脾脏增生的B细胞可能是边缘带B细胞,将这群B细胞用CD21、CD23染色并经流式细胞仪分析,证明这群增生的B细胞正是CD21high/CD23low的边缘带B细胞。为了进一步研究边缘带B细胞的增生机制,采用CD43、CD23双染,然后通过流式细胞仪分选出BCL10Tg/+以及WT小鼠的边缘带B细胞。BCL10Tg/+小鼠的边缘带B细胞群约30%可以在含5%FBS的RPMI-1640中存活1周以上,而WT小鼠的边缘带B细胞群在第3天几乎全部死亡(P<0.01),这一结果说明,BCL10的高表达引起边缘带B细胞的抗凋亡效应。Anti-IgM诱导边缘带B细胞凋亡实验结果显示,BCL10高表达保护anti-IgM诱导的细胞凋亡。结论 BCL10高表达引起脾脏边缘带B细胞扩增,扩增的B细胞具有抗凋亡特性,这种抗凋亡特性影响抗原受体信号传导途径。这些结果可以在一定程度上解释因BCL10高表达而引起的MALT淋巴瘤的发病分子机制。     

BCL10高表达与MALT淋巴瘤发生分子机制的探讨

目的:运用EμSR-BCL10转基因小鼠模型研究BCL10高表达致黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤的分子机制.方法:用IgM+/CD21 lugh/CD23 low荧光标记的抗体染色后进行流式细胞仪分析MZ B细胞;用CD43和CD23磁珠抗体双阴性分离方法获得MZ B细胞并用于体外增殖刺激实验;使用anti-IgM体内注射法研究BCL10体内抗凋亡.结果:MZB细胞增生与BCL10蛋白表达水平存在量效关系.细胞增殖实验结果显示,anti-IgM刺激时转基因小鼠的MZB细胞比FVB野生型小鼠对照增殖高2～5倍,但在LPS或PMA+ Ionomycin刺激时,两者差异无统计学意义.同时anti-IgM体内注射能诱导FVB小鼠的MZ B细胞凋亡,但转基因小鼠的MZ B细胞不发生凋亡.结论:BCL10表达水平与MALT淋巴瘤的前体细胞-MZ B细胞的增生具有正相关的量效关系,其导致增生的机制是其位于BCR受体下游使MZ B细胞在BCR受到刺激时增殖增强并且不发生凋亡.     

DNA甲基化转移酶3B在脑胶质母细胞瘤中的差异表达

目的 脑胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)中存在广泛的基因组低甲基化,本研究检查了DNA甲基化转移酶3B (DNA methyltransferase 3B,DMNT3B)是否在这种肿瘤中的表达和突变情况,以期寻找肿瘤基因组低甲基化发生的原因。方法用RNA抽提试剂盒从 25例人脑胶质母细胞瘤组织中提取总RNA,用反转录聚合酶链反应方法扩增 DNMT3B 的cDNA,然后测序,所得序列经DNASTAR软件与NCBI发表的正常序列进行比对。结果 从25例脑胶质母细胞瘤样本中的成功扩增了全长 DNMT3B cDNA,测序分析结果显示 DNMT3B 基因在该肿瘤样本中差异性存在多种剪接变异体,以 DNMT3B-V1、DNMT3B-V3、DNMT3B-V7 为主。没有发现改变氨基酸序列的点突变。结论 DNMT3B 基因在脑胶质母细胞瘤中没有点突变,但存在多种剪接变异体(以 DNMT3B-V3、DNMT3B-V7 为主),其是否为脑胶质母细胞瘤的广泛基因组低甲基化的原因尚有待进一步研究。