PRMT2剪接体在乳腺癌细胞株中的表达

目的 检测并观察蛋白质精氨酸甲基转移酶2(protein arginine methyltransferase 2,PRMT2)及其新的剪接体PRMT2α、PRMT2β、PRMT2γ在雌激素受体α(estrogen receptor α,ERα)阳性和ERα阴性乳腺癌细胞株中的表达情况.方法 提取ERα阳性乳腺癌细胞株(ZR-75-1、BT474、T47D、MCF-7)和ERα阴性的乳腺癌细胞株(MDA-MB-453、SK-BR-3、MDA-MB-231)总RNA并用RT-PCR方法检测PRMT2及其新剪接体mRNA的表达,采用内对照甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)同时进行相对定量以进行校正.结果 不同乳腺癌细胞株中均可检测到PRMT2及其新剪接体的表达,在ERα阳性乳腺癌细胞株(ZR-75-1、BT474、T47D、MCF-7)中表达均较高,而在ERα阴性的乳腺癌细胞株(MDA-MB-453、SK-BR-3、MDA-MB-231)中表达均较低.结论 PRMT2与PR MT2α 、PRMT2β、PRMT2γ基因在不同乳腺癌细胞株中存在差异表达,在ERα阴性乳腺癌细胞中低于ERα阳性乳腺癌细胞,PRMT2各剪接体有可能和PRMT2一样通过ERα信号途径影响乳腺癌的发生发展.     

p53突变在三阴性乳腺癌转移中的作用及机制

三阴性[雌激素（estrogen receptor,ER）、孕激素受体（progesterone receptor,PR）与人表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor 2,HER-2）均为阴性]乳腺癌（triple negative breast cancer,TNBC）是一个具有特殊生物学行为及临床特征的乳腺癌亚型,而转移是其发病和致死的最主要原因。最近的研究表明,在TNBC中,高频率的p53突变能使p63转录活性丧失,此外,Shar p1作为p53突变/p63调节的主要基因之一,它抑制乳腺癌转移的功能亦丧失,而Shar p1之所以能抑制TNBC的浸润性转移,是因为Sharp1是促进缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor,HIF）降解以及减弱HIF诱导癌细胞恶变的重要因子,从而促进TNBC的转移。所以本文通过在中国知网、Pubmed和Highw ire上检索并研究近100篇文献的基础上,就p53突变通过p63/Shar p1/HIF信号通路促进TNBC转移的作用及机制做一综述。     

pEGFP-N1-过氧化物酶体增殖物激活受体γ载体构建及在兔骨髓间充质干细胞中的表达

背景:过氧化物酶体增殖物激活受体γ是细胞分化重要的调控因子,通过调节其他转录因子的表达,参与调节骨髓间充质干细胞的分化.目的:构建pEGFP-N1-过氧化物酶体增殖物激活受体γ真核表达载体,体外转染兔骨髓间充质干细胞,为过氧化物酶体增殖物激活受体γ受体功能和基于过氧化物酶体增殖物激活受体γ受体靶点的药物筛选提供分子研究平台.设计、时间及地点:单一样本观察,于2007-09/2008-07在南华大学附属一医院临床研究所完成.材料:选择雄性2-5月龄新两兰大白兔,用丁分离培养骨髓间充质干细胞.方法:应用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞,贴壁法不断纯化.从正常小鼠的肝组织中提取总RNA,反转录-聚合酶链反应法获得过氧化物酶体增殖物激活受体γcDNA.经Xho Ⅰ,Apa Ⅰ双酶切,定向克隆到真核表达载体pEGFP-N1,构建重组质粒pEGFP-N1-过氧化物酶体增殖物激活受体γ.主要观察指标:经酶切分析和测序鉴定重组质粒中过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因的完整性和真实性,脂质体介导下体外转染骨髓间充质干细胞,荧光倒置显微镜下观察瞬时表达及转染效率,提取总RNA和总蛋白,进行反转录-聚合酶链反应和Western blot检测.结果:获得的过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因片段经酶切和测序鉴定正确,重组质粒经酶切和测序鉴定证实构建正确,成功转染骨髓间充质干细胞,在其中检测到目的基因及蛋白表达.结论:实验成功构建了pEGFP-N1-过氧化物酶体增殖物激活受体γ重组质粒,同时在转染的骨髓间充质干细胞中获得了过氧化物酶体增殖物激活受体γ的高效表达.     

PPARγ基因转染对兔骨髓间充质干细胞向脂肪细胞早期分化的调控作用

目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)基因转染对骨髓间充质干细胞(MSC)向脂肪细胞早期分化的调控作用.方法 原代培养新西兰大白兔MSC,应用脂质体转染法将pEGFP-N1-PPARγ表达载体转入MSC中,G418筛选,成脂诱导剂诱导向脂肪细胞分化,分成不诱导组(A组)、空转染诱导组(B组)及转染诱导组(C组),采用RT-PCR方法检测PPARγ、脂蛋白脂酶(LPL)mRNA表达,免疫细胞化学染色检测PPARγ、LPL蛋白表达,油红O染色法行脂肪细胞计数和定量.结果 A组细胞内没有脂滴出现,C组成脂率和脂肪含量明显高于B组(P<0.05);A组PPARγ、LPL mRNA及蛋白均不表达,C组PPARγ、LPL mRNA及蛋白表达水平显著高于B组(P<0.01).结论 PPARγ基因转染可增强MSC向脂肪细胞早期分化的能力,缩短分化进程,提高分化效率.     

靶向PRMT2基因的micro RNA对雌激素介导的乳腺癌MCF7细胞增殖的影响

目的:构建靶向人蛋白质精氨酸甲基转移酶 2 (protein arginine methyltransferase2,PRMT2)基因的microRNA真核表达载体,鉴定其稳定转染乳腺癌细胞株MCF7后对细胞增殖的影响。方法:根据PRMT2mRNA序列设计合成pre-microRNA片段,定向克隆至pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体,并稳定转染入MCF7细胞。采用间接免疫荧光法和蛋白质印迹法检测重组体对PRMT2表达的干扰效果以确定其生物活性。采用结晶紫实验和平板克隆形成实验检测重组体转染对MCF7细胞体外增殖和细胞克隆形成能力的影响。FCM法检测重组体转染对MCF7细胞周期的影响。结果:构建的重组体插入片段的碱基序列完全正确,并且重组体稳定转染MCF7细胞后可成功干扰PRMT2基因的表达。在无处理因子的情况下,重组体转染对细胞的生长速度无明显影响;与转染空载体的MCF7细胞相比,稳定转染重组体的MCF7细胞对雌激素的敏感性增强,但其对雌激素拮抗剂4-OHT处理的敏感性无明显差异。平板克隆形成实验表明,重组体能够增强雌激素介导的MCF7细胞的克隆形成能力。FCM法检测表明,转染重组体的MCF7细胞中G2期细胞比例明显升高(P<0.05)。结论:成功构建靶向PRMT2基因的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体,且在稳定转染MCF7细胞后具有生物学活性。抑制内源性PRMT2基因的表达能够提高雌激素介导的MCF7细胞的增殖和克隆形成能力,上调雌激素受体α目标基因cyclinD1和c-myc的表达,促进细胞周期进程。     

肿瘤相关基因的选择性剪接

选择性剪接（alternative splicing）又称变位剪接或可变剪接,指的是从一个mRNA前体通过选择不同的剪接位点组合产生不同的mRNA剪接变异体的过程。该过程是生物界普遍存在的现象,它在机体发育、组织特异性表达、疾病发生和发展等方面起重要作用,是生物体内一种基本且重要的调控机制。近年来,越来越多的研究显示,在人类肿瘤发生发展过程中RNA的选择性剪接扮演着重要的角色。     

PPARγ基因转染对兔骨髓间充质干细胞向脂肪细胞早期分化的影响

目的:探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)基因表达在骨髓间充质干细胞(MSC)向脂肪细胞早期分化中的调控作用及对脂肪分化相关蛋白(ADRP)表达的影响.方法:原代培养新西兰大白兔MSC,应用脂质体转染法将pEGFP-N1-PPARγ表达载体转入MSC中,G418筛选.成脂诱导剂诱导向脂肪细胞分化,RT-PCR检测PPARγ,ADRPmR-NA表达,Western Blot检测ADRP蛋白表达,细胞形态学、油红O染色法行脂肪细胞计数和定量.结果:未分化的MSC中PPARγ,ADRPmRNA不表达,经pEGFP-N1-PPARγ转染后,调控成脂肪细胞方向分化的转录因子和早期标志PPARγmRNA(0.87±0.08 vs 0.28±0.01,P<0.01),ADRPmRNA(0.52±0.03 vs 0.21±0.02,P<0.01)表达增强;MSC向成脂肪细胞方向分化,成脂率及脂质量提高,分别为(78.5±4.2)% vs (51.4±3.0)%和(0.46±0.05) vs (0.21±0.02),P<0.05;分化成脂的细胞ADRP蛋白表达呈阳性,转染组较空转染组表达增强.结论:PPARγ在MSC向脂肪细胞分化的早期中起重要的正向调节作用,并促进ADRP基因和蛋白的表达;PPARγ基因过表达可增强MSC向脂肪细胞分化的能力,缩短分化进程,提高分化效率,可能与增强ADRP的表达有关.     

葛根素对糖尿病肾病大鼠内皮素表达的影响

目的观察葛根素对糖尿病肾病内皮素表达的影响。方法利用链脲佐菌素腹腔注射法诱导建立1型糖尿病大鼠模型,将实验用SD大鼠随机分正常对照组、糖尿病组、葛根素治疗组。治疗12周,观察治疗期间及治疗后大鼠的一般状况、血糖、尿素氮、血肌酐,内生肌酐清除率、24 h尿蛋白排泄率,免疫组织化学检测肾小球ET表达。结果造模组大鼠均出现肾脏功能损害;葛根素能改善基本状况,降低糖尿病大鼠的尿素氮、血肌酐、24 h尿白蛋白排泄率,增加内生肌酐清除率,ET表达显著降低。结论葛根素具有确切的肾脏保护作用。     

无血清处理对甲状腺癌TT细胞内S100A13及FGF-1释放机制的初步研究

目的 探讨无血清处理人甲状腺髓样癌细胞(TT细胞)内S100A13及成纤维细胞生长因子1( FGF-1)蛋白释放的机制,初步阐明Ca2+在S100A13及FGF-1蛋白释放过程中的作用.方法 Western印迹检测无血清处理TT细胞S100A13及FGF-1蛋白表达;ELISA检测培养上清液FGF-1蛋白浓度;激光共聚焦显微镜实时动态检测无血清处理TT细胞1h内Ca2+浓度([Ca2+]i)变化;间接免疫荧光观察TT细胞内S100A13及FGF-1蛋白荧光分布.结果 无血清处理TT细胞4h和6h后S100A13及FGF-1蛋白表达降低(P＜0.05或P＜0.0l),而TT细胞培养上清液中FGF-1蛋白浓度升高(P＜0.05或P＜0.01).激光共聚焦Ca2+荧光显像发现无血清处理TT细胞23 min内[Ca2+]i保持相对稳定,23 min后[Ca2+]i迅速上升达到峰值1.6μmol/L,第40 win后下降至一个较低水平,第40 min至第60 min[ Ca2+]i接近0.3～0.6 μmol/L.1h内TT细胞平均[Ca2+]i明显高于正常培养组、EGTA组和BAPTA-AM组.加入钙离子螯合剂EGTA组和BAPTA-AM组TT细胞内的S100A13、FGF-1蛋白表达无明显下降.结论 无血清处理诱导TT细胞内S100A13及FGF-1蛋白的释放与[Ca2+]i变化有关;Ca2+螯合剂EGTA、BAPTA-AM能有效拮抗无血清处理引起的TT细胞[Ca2+]i升高,并抑制S100A13及FGF-1蛋白的释放.