人端粒酶逆转录酶-双自杀基因对肝癌的靶向杀伤作用

目前联合基因治疗最常用的是有单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)和大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD).同时,肿瘤的基因治疗要求导人的自杀基因表达严格限制于靶细胞(肿瘤细胞),而对正常细胞的生长无影响,因此寻找肿瘤细胞的靶点成为哌待解决的现实问题[1].端粒酶是维持端粒长度的一种逆转录酶,对细胞增殖、衰老及永生化和癌变起重要作用[2].在端粒酶的二三个亚单位中端粒酶逆转录酶(hTERT)是其活性的关键限速步骤,因而hTERT启动子将成为基因靶向表达的理想开关[2].已有研究证实CD、TK自杀基因治疗肿瘤已取得了初步成效[4,5],但是两者联合应用,尤其是在hTERT启动子特异调控下靶向抗肝癌,研究尚少.本研究旨在观察评价hTERT启动子驱动下的联合自杀基因体系对肝癌细胞靶向高效表达.     

Ad-hTERTp-单纯疱疹病毒胸苷激酶／丙氧鸟苷系统联合奥沙利铂对人类肝癌细胞的影响

目的研究腺病毒介导的Ad—hTERTp一单纯疱疹病毒胸苷激酶／丙氧鸟苷（Ad-hTERTp—HSV—TK／GCV）自杀基因系统联合奥沙利铂对人类肝癌细胞HepG2的体外杀伤作用。方法将带有hTERT启动子驱动HSV—TK基因的重组复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-HSV-TK作为载体。感染复数（MOI）为100转染HepG2细胞,观察不同浓度的Ad-hTERTp—HSV-TK／GCV、奥沙利铂及二者联合对HepG2细胞生长的影响。用锥虫蓝活细胞拒染法、四甲基偶氮唑盐比色（MTF）法检测各干预组肝癌细胞生长的抑制率。结果3组HepG2细胞的生长均不同程度被抑制,且随药物浓度的增加抑制作用显著增强。Ad—hTERTp—HSV。TK／GCV联合奥沙利铂组抑制率最高（86．63％）,与Ad—hTERTp—HSV．TK／GCV组抑制率（72．12％）及奥沙利铂组抑制率（59．41％）相比差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论Ad—hTRTq：Tp—HSV—TK／GCV联合奥沙利铂可显著增强对HepG2细胞的杀伤作用,增加靶向性的同时可以降低药物浓度,对临床用药有指导意义。     

重组腺病毒Ad-hTERTp-HSV-TK/GCV系统对小鼠肝癌腹腔种植腹腔积液生成的影响

目的 研究重组腺病毒Ad-hTERTp-HSV-TK/GCV系统对小鼠肝癌腹腔种植腹腔积液生成的影响及其作用机制.方法 sx_1,近交系小鼠腹腔内接种肝癌H22细胞株后,随机分为四组,48 h后分别给予相应的治疗.观察各组小鼠腹腔积液及生存时间的变化;流式细胞术测定肿瘤细胞凋亡百分率;透射电镜观察腹腔内肿瘤细胞的形态学变化.结果 与Ad-hTERTp-HSV-TK组、GCV组和空白对照组三组相比,Ad-hTERTp-HSV-TK/GCV组可以显著抑制小鼠腹腔积液的生成(P<0.01),延长生存期(P<0.01),肿瘤细胞凋亡率为(27.12±2.12)%明显高于其他各组(P<0.01),并且在治疗期间未发现明显不良反应.结论 Ad-hTERTp-HSV-TK/GCV系统可通过诱导肝癌细胞凋亡而抑制小鼠腹腔积液生成,并延长生存期,是一种安全可行的治疗方法.     

重组腺病毒Ad—hTERTp—HSV—TK载体的构建及抗肝癌实验研究

目的构建hTERT启动子调控的HSV—TK基因重组腺病毒载体系统,观察Ad—hTERTp—HSV-TK／GCV自杀基因系统对肝癌细胞的杀伤作用。方法将穿梭质粒pSU-Tp-TK与腺病毒骨架质粒pBHGE3共转导至HEK293细胞,利用细胞内同源重组法构建出hTERT启动子调控的携带TK基因的复制缺陷型腺病毒Ad—hTERTp—HSV—TK载体系统;将不同感染复数（MOI=1、10、100、1000）的重组腺病毒Ad—hTERTp—HSV—TK感染肝癌细胞HepG2及正常肝细胞L-02,加入不同浓度的GCV（0、1、10、100、1000ug／ml）,MTT、法检测细胞活性。结果HEK293细胞出现病毒空斑,提取病毒DNA,经PCR鉴定正确后扩增、纯化,滴度为1．5×10^10pfu／ml;MTT法检测到Ad—hTERTp—HSV-TK／GCV能靶向杀死肝癌细胞HepG2,且细胞存活率随着病毒滴度和GCV浓度的增加而降低。结论该实验构建的Ad—hTERTp—HSV—TK载体系统,可靶向抑制肝癌细胞HepG2,而对正常肝细胞L-02几乎无影响。     

重组腺病毒Ad—hTERTp-HSV—TK／GCV系统的构建及其对人肝癌细胞HepG2的杀伤作用及旁观者效应研究

背景与目的:肝癌的基因治疗已成为肝癌治疗的重要发展方向,本文探讨Ad-hTERTP-HSV-TK/GCV系统对人肝癌细胞株HepG2的杀伤作用;并观察其过程中旁观者效应的作用。方法:用重组腺病毒Ad-hTERTP-HSV-TK系统分别感染肝癌细胞株HepG2和正常肝细胞L-02,加入前体药物更昔洛韦(GCV),四甲基偶氮唑盐比色法检测其对感染后细胞的杀伤作用;将感染后的TK阳性HepG2细胞和未感染的TK阴性HepG2细胞按不同比例浓度(0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0)混合,观察其旁观者效应。结果:肝癌细胞HepG2的存活率随病毒感染复数(MOI)和GCV浓度增加而逐渐降低,L-02细胞无明显变化。旁观者效应表明,在TK阳性HepG2细胞为10%时,细胞抑制率达28.06%,70%时达90.44%。结论:重组腺病Ad-hTERTP-HSV-tk/GCV系统对肝癌细胞HepG2有选择性杀伤作用及明显的旁观者效应。     

Ad-hTERTp-HSV-TK/GCV系统对肝癌腹水抑制效应的实验研究

目的:探讨由人端粒酶逆转录酶启动子驱动单纯疱疹病毒胸腺激酶基因的重组腺病毒,联合更昔洛韦(GCV)对肝细胞癌腹水生成的影响.方法:将H22细胞注入小鼠腹腔建立肝癌腹水瘤模型,并通过观察各组小鼠体质量、腹围、腹水量、生存时间、脏器及细胞凋亡率等指标的差异.揭示Ad-hTERTp-HSV-TK/GCV系统对肝癌腹水的治疗作用.结果:经过Ad-hTERTp-HSV-TK/GCV治疗的小鼠,显示出明显的腹水抑制作用,其腹水量显著低于各对照组(P<0.01),生存时问延长(P<0.01),细胞凋亡率提高(P<0.01).并且无明显毒副反应.而单独使用Ad-hTERTp-HSV-TK和GCV对腹水生成无明显作用.结论:Ad-hTERTp-HSV-TK/GCV系统对肝癌细胞有较强的靶向杀伤作用,治疗肝癌腹水效果显著,对其临床应用具有理论意义.     

重组腺病毒Ad-hTERTp-HSV-TK／GCV系统

 目的　研究重组腺病毒Ad-hTERTp-HSV-TK／GCV系统对小鼠肝癌腹腔种植腹腔积液生成的影响及其作用机制。方法　SX1近交系小鼠腹腔内接种肝癌H22细胞株后,随机分为四组,48 h后分别给予相应的治疗。观察各组小鼠腹腔积液及生存时间的变化;流式细胞术测定肿瘤细胞凋亡百分率;透射电镜观察腹腔内肿瘤细胞的形态学变化。结果　与Ad-hTERTp-HSV-TK组、GCV组和空白对照组三组相比,Ad-hTERTp-HSV-TK／GCV组可以显著抑制小鼠腹腔积液的生成（P＜0.01）,延长生存期（P＜0.01）,肿瘤细胞凋亡率为（27.12±2.12）%明显高于其他各组（P＜0.01）,并且在治疗期间未发现明显不良反应。结论　Ad-hTERTp-HSV-TK／GCV系统可通过诱导肝癌细胞凋亡而抑制小鼠腹腔积液生成,并延长生存期,是一种安全可行的治疗方法。