miR-221通过调节PTEN影响肺癌细胞对吉非替尼的耐药性

目的:探讨微小RNA-221(miR-221)在人肺癌细胞对吉非替尼耐药中的作用及其相关机制。方法:RT-qPCR检测人肺腺癌吉非替尼敏感细胞PC9和吉非替尼耐药细胞PC9/GR中miR-221的表达;通过脂质体试剂Lipofectamine 2000把miR-221 inhibitor转染入肺癌PC9/GR细胞内,CCK-8法检测细胞对吉非替尼敏感度的变化,Western blot检测第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物(PTEN)的蛋白表达。构建含PTEN 3’-UTR的萤光素酶报告载体,验证miR-221对PTEN的靶向调控作用。结果:PC9/GR细胞的miR-221表达水平明显高于PC9细胞(P0.05)。PC9/GR细胞中PTEN表达水平低于PC9细胞(P0.05)。转染miR-221 inhibitor后,吉非替尼对PC9/GR细胞的IC_(50)明显降低,PTEN的蛋白表达增加(P0.05)。萤光素酶活性检测实验显示抑制miR-221表达能增强PTEN的萤光素酶活性(P0.05)。结论:miR-221可能通过抑制PTEN的表达,增强肺癌细胞对吉非替尼的耐药性。     

兼具抗氧化和γ⁃氨基丁酸增强活性的多功能抗脑卒中化合物

目的：合成具有抗氧化和γ?氨基丁酸（γ?aminobutyric acid,GABA）增强活性的神经保护试剂并测试其抗脑卒中的神经保护作用。方法：从不同取代的酚出发合成依达拉奉的类似物,用1,1?二苯基?2?苦肼基（1,1?diphenyl?2?picryhydrazyl,DPPH）法测试化合物的抗氧化活性,用膜片钳技术测试化合物的GABA活性,并用大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型测试化合物的神经保护作用。结果：合成了3’,5’?二异丙基?4’?羟基依达拉奉（6a）和3’?甲基?5’?叔丁基?4’?羟基依达拉奉（6b）,两个化合物都显示了良好的体外抗氧化活性,在MCAO模型上两个化合物都显示了比依达拉奉更强的神经保护作用;电生理实验表明,化合物6b在低浓度下显示GABA增强活性,在高浓度下显示直接的GABAR激动活性。结论：基于依达拉奉的分子骨架,成功构建了同时具有抗氧化活性和GABA增强活性的新型神经保护试剂。     

上调SMYD3对人胆管癌FRH0201细胞中DNMT3B表达及细胞增殖的影响

目的: 研究人胆管癌细胞株FRH0201中SET和MYND结构域含有蛋白3(SET and MYND domain-containing protein 3,SMYD3)过度表达对DNA甲基化转移酶3B(DNA methyltransferase 3B,DNMT3B)表达及细胞增殖能力的影响。方法: 瞬时转染SMYD3真核表达质粒后, RT-PCR检测细胞中DNMT3B mRNA水平的变化;Western blotting检测细胞中DNMT3B蛋白水平的变化;CCK-8检测细胞增殖能力的改变;流式细胞术检测细胞周期的改变。结果: 以未处理组为对照,胆管癌细胞FRH0201在转染pEGFP-C3-SMYD3质粒后,DNMT3B蛋白及mRNA表达均显著上升(P<0.01);细胞的增殖能力显著提高、细胞增殖速度加快(P<0.05);进入G₂/M期的细胞明显增多(P<0.05)。结论: 过度表达SMYD3,可引起细胞中DNMT3B的表达上调并增强细胞增殖能力。     

核转录因子-κB与肿瘤上皮间质转化

 核转录因子-κB（NF-κB）是肿瘤上皮间充质转化（EMT）的重要调节因子。肿瘤发生EMT能够增强肿瘤浸润及远处转移能力,是肿瘤耐药的原因之一。目前研究发现,信号转导因子Snail、Slug、Twist、Zeb等在NF-κB调控肿瘤EMT中起重要作用。药物及靶向干扰NF-κB可以逆转肿瘤EMT。NF-κB有望成为将来肿瘤治疗的有效靶点之一。     

急性髓系白血病患者骨髓涂片FMS样酪氨酸激酶3、NPM1和c-kit基因检测及临床研究

目的：探讨提取贮存骨髓涂片DNA的方法,通过对急性髓系白血病（AML）患者FMS样酪氨酸激酶3（FLT3）、NPM1及c-kit基因突变进行检测,分析三种基因突变与AML临床特征之间的关系。方法收集55例AML患者骨髓涂片,采用聚合酶链反应（PCR）、DNA测序和分子克隆方法对FLT3-内部串联重复（ITD）、NPM1和c-kit基因突变进行检测及分析,记录患者疾病缓解、进展及生存时间。结果实验证实对于低温冻存、未经瑞特染色、未用化学方法固定的骨髓涂片标本及室温贮存、经瑞特染色脱色后的标本均能用苯酚∶氯仿∶异戊醇法成功提取DNA。从骨髓涂片中提取的DNA可用于PCR、直接测序和分子克隆测序分析。在55例AML患者中,FLT3-ITD阳性10例（18.2%）,其中9例为杂合型突变,1例为纯合型突变。FLT3-ITD阳性组较阴性组完全缓解（CR）率低,无事件生存（EFS）和总生存（OS）时间短（P＜0.05）。NPM1基因杂合型突变9例（16.4%）,全部为A型突变。10个月以内NPM1突变组患者EFS率比野生组高（P＜0.05）,19个月以内NPM1突变组OS率比野生组高（P＜0.05）。9例NPM1突变患者中FLT3-ITD阳性3例,CR率由高到低依次为NPM1+ FLT3-ITD-、NPM1- FLT3-ITD-、NPM1- FLT3-ITD+、NPM1+ FLT3-ITD+（P＜0.05）,且NPM1- FLT3-ITD+是影响OS的危险因素（RR＝1.250,P＝0.005）。55例患者中,c-kit基因突变2例（3.6%）,分别为D816H突变型和D816V突变型;c-kit基因突变患者与FLT3-ITD阳性及NPM1突变患者无重叠。结论 FLT3-ITD突变为AML患者预后不良的分子标志,NPM1基因突变可能提示预后较好,NPM1- FLT3-ITD+是影响OS的危险因素。AML中c-kit基因突变率低,未见其与FLT3、NPM1基因突变重叠。     

miR-221通过下调PTEN促进肺癌A549细胞增殖

目的:探讨微小RNA-221(miR-221)对肺癌A549细胞增殖的影响及其相关作用机制。方法:通过脂质体转染试剂Lipofectamine 2000把miR-221 mimics转染入肺癌细胞A549内,RT-q PCR检测miR-221和PTEN mRNA的表达;Western blot检测PTEN蛋白表达;CCK-8及平板克隆形成实验检测细胞增殖能力。构建含PTEN 3'-UTR的萤光素酶报告载体,检验miR-221对PTEN的靶向调控作用。结果:转染miR-221后肺癌细胞中miR-221表达水平明显高于对照组及空白组(P0.01),PTEN mRNA及蛋白表达均显著下降(P0.05);细胞增殖及集落形成能力明显增强(P0.05);miR-221能抑制PTEN的萤光素酶活性。结论:miR-221能够抑制肺癌A549细胞中PTEN的表达,并促进细胞增殖。     

NF-κB亚单位p50/p65激活促进肺腺癌H1650细胞吉非替尼耐药

目的探究NF-κB经典通路激活与人肺腺癌H1650细胞吉非替尼耐药的内在联系。方法选择肺腺癌HCC827和H1650 亲代细胞株,吉非替尼连续处理60 d,检测细胞株生长情况和各细胞株595nm吸光度,确定各细胞株细胞存活率和H1650亲代 细胞被诱导成H1650耐药细胞株。Western blot检测各细胞株P-IκBα、NF-κB P-p50和P-p65表达量,Image J灰度仪计算出胞浆 和胞核P-p50和P-p65与内参蛋白灰度比值,比较吉非替尼和吉非替尼加吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC）联合用药状态下,各 细胞株细胞存活率和P-IκB、P-p50和P-p65的表达。结果在无吉非替尼和吉非替尼加PDTC药物干预下,H1650耐药细胞PIκBα 表达增加,胞浆和胞核P-p50和P-p65表达,H1650耐药细胞株>H1650亲本细胞株>吉非替尼敏感HCC827细胞株（P<0.05, P<0.01）;单独使用吉非替尼干预,H1650 耐药细胞株细胞抑制率较H1650 亲本细胞株和HCC827 细胞株降低（P<0.05,P< 0.01）,H1650耐药细胞株P-p50和P-p65表达较其他两类细胞株升高（P<0.05）;与无吉非替尼干预比较,H1650亲代和耐药细胞 P-p50和P-p65均有显著降低（P<0.05,P<0.01）;吉非替尼联合PDTC干预,显示H1650亲代和耐药细胞存活率、胞浆和胞核Pp50 和P-p65表达均较吉非替尼组降低（P<0.01,P<0.01）。结论NF-κB经典传导通路激活是H1650亲代细胞残存和转化为吉 非替尼耐药细胞的主要因素之一,吉非替尼联合PDTC用药可抑制P-IκBα生成和P-p50、P-p65的激活,从而降低H1650残存细 胞生存率和耐药细胞的产生。     

SMYD3过表达对人肝内胆管癌细胞miR-124表达及细胞增殖的影响

 目的：探讨肝内胆管癌细胞HCCC-9810中SET和MYND结构域含有蛋白3（SET and MYND domain-containing protein 3,SMYD3）过表达对miR-124表达及细胞增殖能力的影响。方法：瞬时转染 SMYD3 真核表达质粒后, Western blotting 检测细胞中SMYD3 蛋白水平的变化;qRT-PCR 检测细胞中SMYD3 mRNA 和miR-124 表达;甲基化特异性PCR检测miR-124-1、miR-124-2和miR-124-3基因启动子甲基化水平;CCK-8 和平板克隆形成实验检测细胞增殖能力。结果：以空白组为对照,肝内胆管癌细胞HCCC-9810在转染pEGFP-SMYD3质粒后,SMYD3蛋白及 mRNA 表达均显著上升（P＜0.05）,miR-124-1、miR-124-2和miR-124-3基因启动子甲基化显著增加（P＜0.05）,miR-124表达明显下降（P＜0.05）,细胞增殖能力显著提高（P＜0.05）。结论：过表达 SMYD3可引起miR-124基因启动子甲基化增加,导致胆管癌细胞中miR-124 的表达下降,同时过表达SMYD3可增强细胞增殖能力。