SNP与Car2、Gpi1基因多态性的关联性研究

[摘要] 目的 从单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）水平探索小鼠生化标记基因Car2与Gpi1多态性的形成机理。方法 从DNA、cDNA和蛋白多肽3个方面分析研究Car2与Gpi1基因的多态性。结果 Car2基因DNA和cDNA中有3个SNP与Car2a/b多态性相关,分别为外显子2中的C（T）、G（C）和外显子7中的A（G）;蛋白多肽中发现第38位Gln/His与Car2a/b多态性相关,对应于外显子2中的G（C）。Gpi1基因DNA中没有发现与Gpi1a/b多态性相关的SNP;cDNA水平有2个SNP与Gpi1a/b多态性相关,分别为外显子9中的T(C)和18中的A(G);蛋白多肽中发现第247位Phe/Leu与Gpi1a/b多态性相关,对应于外显子9中的T(C)。结论 Gln/His（38）、Phe/Leu（247）间的转换可能分别是近交系小鼠形成Car2a/b,Gpi1a/b多态性的原因。     

基于超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱技术的清利湿热颗粒入血成分分析

目的：阐明灌胃给予清利湿热颗粒后大鼠体内吸收入血的化学成分。方法：借助超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)技术,采用Agilent ZORBAX RRHD Eclipse XDB-C18色谱柱(2.1 mm×100 mm, 1.8μm),以0.1%甲酸水溶液-乙腈为流动相体系,梯度洗脱,进样量为2μL,在正、负离子模式下对处理后的空白血清和给药后0.5、1、2、4 h不同时间点的血清进行质谱检测。结果：通过与Natural Products HR-MS/MS Spectral Library 1.0数据库对比、文献分析以及质谱裂解规律从血清样品中鉴定出15个原型成分。结论：本研究为清利湿热颗粒标志性成分的选择提供了依据,初步确定了该产品发挥药效的物质基础,也为进一步揭示清利湿热颗粒的作用机制奠定基础。     

神经酰胺通过JNK-c-Jun信号通路诱导胶质瘤细胞自噬性死亡

目的探讨神经酰胺对大鼠脑胶质瘤细胞C6自噬性死亡的影响及其作用机制。方法不同浓度神经酰胺作用于C6细胞后,用MTT法检测细胞的存活率,流式法检测细胞凋亡的改变;Western blotting及电镜的方法观察细胞自噬水平的改变,以及JNK及其下游靶分子c-Jun的磷酸化水平变化;最后进一步借助JNK特异性抑制剂SP600125抑制JNK的活性,观察其对神经酰胺诱导的细胞自噬情况的影响。结果与对照组相比,神经酰胺作用24 h后,C6细胞存活率明显降低,且具有剂量依赖性,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,神经酰胺作用24 h后,C6细胞死亡明显升高且具有剂量依赖性,差异有统计学意义(P<0.05),但其中凋亡性死亡比例较低;神经酰胺作用后细胞内自噬小体数目,LC3B/LC3A的比值,Beclin-1的表达水平,以及JNK和c-Jun磷酸化水平都显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);提前给予JNK特异性抑制剂SP600125抑制JNK的活性后,显著阻断神经酰胺诱导的细胞自噬。结论神经酰胺可诱导胶质瘤细胞C6发生自噬性死亡,其诱导胶质瘤细胞发生自噬的机制可能与激活JNK信号通路有关。     

鱼牡蛎生乳灵胶囊促进大鼠泌乳功能的实验研究

目的： 观察鱼牡蛎生乳灵胶囊(简称生乳灵胶囊)促进大鼠泌乳功能的作用。方法：SD大鼠采用超负荷哺乳模型,设生乳灵胶囊1 800、900、450 mg/kg组和空白对照组,在哺乳期连续灌胃给予受试物25 d,观察哺乳期母鼠体质量、仔鼠体质量、仔鼠存活率和母鼠乳腺组织病理学检查等指标。结果：生乳灵胶囊各剂量组母鼠体质量未见明显异常;450、900 mg/kg组仔鼠生存率在89%~94%,仔鼠窝平均体质量与对照组相比有一定增长,但差异均无统计学意义(P>0.05);而1 800 mg/kg组仔鼠生存率为100%,仔鼠窝平均体质量在哺乳早期(出生后0～8 d)和晚期(出生后17～25 d)出现明显增长(P<0.05),乳腺组织内乳汁较多、腺泡腔充盈、乳腺管扩张明显。结论：生乳灵胶囊在相当于人用量10倍(1 800 mg/kg)时,可以促进哺乳期大鼠的乳汁分泌,增加仔鼠的体质量,减少仔鼠营养不良性死亡。     

不同诱导方式制备的大鼠肝匀浆代谢酶活性及冻储方式的比较

目的：研究7种不同诱导方式制备的大鼠肝匀浆的代谢酶活性,并探讨用低温液体法保存肝匀浆的可行性。方法：SD雄性大鼠,每组6只,分别用苯巴比妥（PB）、β-萘黄酮（βNF）和多氯联苯（PCB）3种诱导剂,在不同给药途径、不同剂量、不同时间、单一诱导或联合诱导等7种不同诱导方式下,制备肝匀浆,并在0、-20和-40℃贮存。选择2-氨基芴（2AF）、吖啶橙（AO）和环磷酰胺（CP）3种间接致突变剂在Ames试验中应用TA100、TA98或TA97,对上述诱导方式和贮存方式、贮存时间下获得的肝匀浆进行肝代谢酶活性的考察。结果：各组肝匀浆对间接致突变剂2AF、AO和CP均呈代谢活酶性阳性;加诱导剂的肝匀浆代谢酶活性比不加诱导剂的更强;联合诱导组的肝匀浆代谢酶活性比单独诱导组的更高;不同给药途径,不同诱导时间、不同诱导剂量、联合诱导与多氯联苯（PCB）诱导等,其肝匀浆代谢酶活性基本一致。加入冰冻保护剂的肝匀浆低温贮存液在4℃可贮存4周;在-20和-40℃下贮存24周代谢酶活性未明显降低。结论：PCB诱导组肝匀浆代谢酶活性与联合诱导组基本一致,均大于单独诱导组,且后者大于未诱导组;给药途径、诱导时间和剂量对肝匀浆代谢酶活性影响不大;肝匀浆低温贮存液保存于-20和-40℃环境下24周内能够保证代谢酶的活性。     

基于BALB/c小鼠的局部淋巴结试验用于皮肤致敏性评价的实验研究

目的：用BALB/c小鼠建立基于掺入溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）和酶联免疫吸附测定（ELISA）的小鼠局部淋巴结试验（LLNA）改良方法（LLNA：BrdU-ELISA）,并对该方法进行评价。方法：试验设溶剂对照组（丙酮/橄榄油、丙酮、二甲基亚砜或蒸馏水）,阳性对照组（25%己基肉桂醛）和受试物组（选择22种化学物和5种化妆品,配成1~3个不同浓度）,每组4只小鼠。每天上午9：00在小鼠双耳背部分别涂抹受试物25 μL,连续染毒3 d,第4天不作处理,第5天腹腔注射BrdU标记液0.5 mL。第6天称量耳廓质量,分离颌下淋巴结称取质量并制成单细胞悬液,用ELISA试剂盒测定淋巴细胞增殖。结果：50%己基肉桂醛、5%二氯化钴、10%乳酸、25%乳酸、50%乳酸和2号染发剂引起耳廓质量显著增加（P < 0.05或P < 0.01）,为刺激阳性,其他化学物和化妆品为刺激阴性;15种化学物（2,4-二硝基氯苯、丁子香酚、异丁子香酚、3-氨基苯酚、反式肉桂醛、己基肉桂醛、香叶醇、对苯二酚、水杨酸己酯、甲醛、戊二醛、六水硫酸镍、二氯化钴、重铬酸钾、乳酸）和2号染发剂为致敏阳性（SI>1.6）,其他化学物或化妆品为致敏阴性。该方法阳性预测率为93.3%,阴性预测率为100%,假阳性率为14.3%,假阴性率为0,灵敏度为100%,特异性为85.7%、准确度为95.2%。结论：LLNA：BrdU-ELISA方法用BALB/c小鼠可较好地评价化学物/化妆品的刺激性和致敏性,可在化妆品安全性评价中发挥重要作用。     

一种快速的leptin~(ob)和leptinr~(db)等位基因SNP分型方法

目的建立leptinob和leptinrdb等位基因的SNP分型方法-单管双向等位基因专一性扩增(single-tubebi-directional allele specific amplification,SB-ASA),同时与传统的PCR-酶切法进行比较分析。方法用PCR-酶切法和SB-ASA方法同时对ob/+杂合小鼠的7只后代小鼠和db/m的9只后代小鼠进行了检测分型。结果两种方法都成功地对ob、db小鼠进行了分型,且结果完全一致。结论成功建立了一种快速的leptinob和leptinrdb等位基因的SNP分型方法-SB-ASA,促进了ob、db小鼠的繁殖育种工作。     

单管双向等位基因专一性扩增方法在近交系小鼠遗传检测中的应用

目的将新近建立的单管双向等位基因专一性扩增(single-tube bi-directional allele specific amplification,SB-ASA)方法用于分析近交系小鼠基因组中的单核苷酸多态性(SNP)。方法以5个近交系小鼠为研究对象,采用SB-ASA方法对其16个SNP位点进行检测,并通过双盲实验和测序验证该方法的可靠性;且考察了该方法中PCR反应各成分及扩增条件对结果的影响。结果16个SNP位点,SB-ASA都成功地对5个品系小鼠进行了分型,与测序结果完全一致;双盲实验结果显示通过3个SNP位点即可鉴别5个品系。结论SB-ASA方法可用于近交系小鼠SNP的遗传检测,可望作为一种新的分子生物学遗传检测方法推广应用。     

LLNA:BrdU-ELISA改良法的建立及其在化妆品安全性评价中的应用

目的建立可快速检测化学物致敏性和刺激性的局部淋巴结试验(LLNA:BrdU-ELISA)改良法,并对化妆品产品进行评价。方法 3种化学物(2,4二硝基氯苯(DNCB)、丁子香酚、己基肉桂醛)和3种化妆品产品作为受试物,雌性BALB/c小鼠连续染毒3天,测量小鼠耳缘厚度,第5天腹腔注射BrdU,第6天称耳廓重,分离颌下淋巴结称重并制取单细胞悬液,用ELISA试剂盒检测淋巴细胞增殖。结果 DNCB(1.0%)、己基肉桂醛(25%、50%)和3号粉底霜引起耳肿胀和耳廓重显著增加(P0.05或P0.01),可能为刺激物,其他均无刺激性;3种化学物和3号粉底霜致敏检测阳性,其他均为阴性。结论结合小鼠耳肿胀和耳廓重的LLNA:BrdU-ELISA改良法可较好地评价化学物和化妆品产品的致敏性和刺激性,有望在化妆品安全性评价中发挥重要作用。     

4个近交系小鼠SNP位点的测定

目的将新近建立的单管双向等位基因专一性扩增（single-tube bi—directional allele specific amplification，SB—ASA）方法用于分析国内近交系小鼠基因组中的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）。方法以国内4个近交系小鼠为研究对象，采用SB-ASA方法对其16个SNP位点进行检测，并通过测序进行验证。结果16个SNP位点，SB-ASA都成功地对4个品系小鼠进行了分型，与测序结果完全一致。结论SB—ASA方法可以准确地检测国内近交系小鼠SNP位点等位基因型。