靶向型辅助腺病毒的构建及其功能研究

目的构建一种新型辅助腺病毒,并用于靶向型第三代腺病毒载体的制备,提高其对造血细胞的感染效率。方法采用重叠PCR的方法合成含有不完全包装信号序列A1-A4和loxP序列的DNA片段SynES,替换穿梭质粒pShuttle中原有的包装信号序列,得到穿梭质粒pShuttle-SynES;将所得穿梭质粒与骨架质粒Ad5/F11p在大肠杆菌BJ5183中同源重组,获得重组腺病毒质粒载体pAd5/F11p-HV,将其转染293细胞包装重组腺病毒Ad5/F11p-HV。参照第三代腺病毒包装策略,利用Ad5/F11p-HV包装获得携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的第三代腺病毒HD-Ad5/F11p-GFP;将其以不同的感染强度感染人白血病细胞系K562、U937、Jurkat和人脐带血CD34+细胞后,采用荧光显微镜和流式细胞术检测GFP的表达。结果采用DAN片段SynES替换穿梭质粒pShuttle上的包装信号,获得新的穿梭质粒pShuttle-SynES;进一步构建获得重组腺病毒质粒pAd5/F11p-HV,并制备了辅助腺病毒Ad5/F11p-HV。采用该辅助腺病毒包装pC4HSU-GFP,获得了第三代腺病毒HD-Ad5/F11p-GFP;CsCl密度梯度离心分离HD-Ad5/F11p-GFP和Ad5/F11p-HV,获得了高质量的HD-Ad5/F11p-GFP。与对照病毒HD-H14-GFP相比,HD-Ad5/F11p-GFP可明显提高对人白血病细胞U937、Jurkat和人脐带来源CD34+细胞的感染效率。结论设计并构建了一种靶向性辅助腺病毒,并以此为基础成功制备了对造血细胞高效感染的第三代重组腺病毒。     

重组腺病毒Ad5-KAI1对骨髓瘤细胞的功能调节作用

目的研究抗癌一号KAI1（又称CD82）基因对骨髓瘤细胞生物学特性的影响及机制。方法将携带KAI1基因克隆至重组腺病毒,制备Ad5-KAI1重组腺病毒,并感染骨髓瘤细胞SKO-007。Ad5-GFP作为阴性对照,未感染细胞为空白对照,利用CCK-8和AnnexinⅤ-PI等方法分别检测不同时间点（24 h,48 h）的细胞活率和凋亡水平。另外,利用W estern印迹方法检测不同组别细胞表达ERK及其磷酸化水平。结果 Ad5-KAI1组细胞活率抑制水平和凋亡水平明显高于对照组,且剪切型胱天蛋白酶（caspase）3、ERK磷酸化水平在实验组高表达,而抑制ERK磷酸化则导致凋亡进一步增加。结论 KAI1显著抑制骨髓瘤细胞增殖,并诱导其caspase依赖的凋亡;KAI1在促进凋亡的同时,其应激性诱导了ERK磷酸化,后者又对细胞具有保护作用。     

双硫仑对人脂肪肉瘤细胞系SW872细胞的抑制作用及其机制

目的观察双硫仑(DSF)对人脂肪肉瘤细胞SW872的抑制作用,并探讨其相关分子机制。方法体外培养SW872细胞,设立正常细胞对照组及DSF 1,2.5,5和10μmol·L^-1组,采用CCK-8法检测药物处理24 h后对细胞增殖的抑制作用;光镜下观察DSF处理后SW872细胞形态变化;流式细胞术检测细胞凋亡;克隆形成实验检测DSF对SW872细胞克隆形成能力的影响;Western印迹法检测A20的表达;CCK-8法检测铁离子螯合剂Fer-1及炎症小体NLRP3抑制剂MCC950能否逆转DSF对SW872细胞的抑制作用;RT-PCR法检测DSF对SW872细胞中A20和醛脱氢酶(ALDH1)的mRNA水平。结果 DSF对SW872细胞增殖有显著抑制作用(P<0.01);DSF处理后使SW872细胞发生皱缩变圆且细胞间隙增大;DSF作用于SW872细胞24 h后,与正常细胞对照组相比,DSF 1μmol·L^-1组细胞早期凋亡率明显增加〔(32.6±1.82)%vs(3.50±0.64)%,P<0.05〕;DSF 0.1μmol·L     

CD147与子宫内膜异位症的相关性研究

目的：探讨和比较免疫球蛋白超家族分子CD147在子宫内膜异位症患者异位子宫内膜、在位子宫内膜及健康人子宫内膜中表达及定位。方法：采用免疫组化方法对30例异位子宫内膜及其18例同期在位子宫内膜和15例健康人子宫内膜组织中的CD147的表达进行观察。结果：异位子宫内膜标本中CD147表达增强,以膜分布为主;而无论有无子宫内膜异位症,在位子宫内膜中CD147表达无差异。结论：CD147分子表达在异位子宫内膜和正常子宫内膜存在明显差异。CD147可能与子宫内膜异位症的发生密切相关。     

体外筛选抑制K562细胞生长的放线菌代谢物

目的：建立一种适合较大量微生物代谢物抑制K562细胞生长的体外筛选方法，筛选对K562细胞具有抑制作用，而对正常细胞Vero无明显抑制作用的土壤放线菌提取物。方法：放线菌培养液加入乙醇后，置于96孔板中。经过减压除去溶剂后，用MTT法检测各样品对K562及Vero细胞的抑制作用。结果与结论：从446种土壤放线菌提取物中筛选获得5种提取物对K562细胞具有明显的抑制作用，而对Vero细胞生长抑制作用较弱。     

MicroRNA-17-92 簇对 K562 细胞生物学特性的影响及机制初探简

本研究旨在探讨microRNA-17-92对K562细胞生物学特性的影响.以K562细胞系为模型,采用lipofectin2000转染miR-17-92 mimic,应用Q-PCR方法鉴定基因表达水平,CCK-8细胞增殖检测试剂盒检测K562细胞增殖活性,Annexin V-FITC/PI标记检测K562细胞的凋亡;细胞经过乙醇固定后利用流式细胞仪检测K562细胞周期变化,Western blotting检测相关蛋白Crk的表达.结果显示：K562细胞系转染miR-17-92 mimic后miR-17-92表达增高;miR-17-92高表达后K562细胞的增殖能力增强、在细胞周期方面由G1期向S期细胞增加;同时,miR-17-92 mimic能够抑制乏血清诱导的K562细胞凋亡;Western blot检测显示miR-17-92 mimic促进Crk蛋白的表达.结论：miR-17-92可以促进K562细胞增殖,抑制其凋亡并调控细胞周期变化.     

免疫组化法检测NSCLC骨髓微转移的临床研究

目的：探讨免疫组化检测非小细胞肺癌（NSCLC）患者骨髓微转移（BMM）的灵敏度、特异性及临床应用价值。方法：应用免疫组化法检测68例经病理检查证实的NSCLC患者骨髓（临床分期I－Ⅲ期53例，Ⅳ期15例）细胞角蛋白表达，诊断肺癌BMM。结果：免疫组化检测BMM的敏感度可达10^-5水平；I－Ⅲ期患者BMM阳性率为22．6％（12／53）；性别、年龄、卡氏评分、病理类型等因素对BMM阳性率无显著性影响；Ⅳ期患者BMM阳性检出率为53．3％（8／15），显著高于I－Ⅲ期患者。结论：免疫组化方法检测NSCLC患者的BMM具有较好的敏感性和特异性，适于临床应用。     

创伤合并γ射线照射后大鼠脾脏Treg/Th17平衡的变化及其意义

目的 观察创伤大鼠经SGy γ射线全身照射后伤口愈合情况及脾脏Treg/Th17平衡变化的特点,探讨两者之间的关系及意义.方法 清洁级雌性Wistar大鼠65只,按体重随机分为正常对照组(正常组)、单纯创伤组(单伤组)和创伤+5Gy γ射线全身照射组(伤照组).分别于伤照后1、3、7、14、21、28d,检测各组大鼠伤口残留面积及外周血白细胞和淋巴细胞计数,并采用流式细胞仪测定脾脏Treg细胞和Th17细胞亚群的变化.结果 伤照后7～21d伤照组伤口残留面积持续大于单伤组(P＜0.01),21d时单伤组伤口已基本愈合,而伤照组延迟至28d才基本愈合.单伤组伤照后1～ 7d外周血白细胞及淋巴细胞计数均明显低于正常组(P＜0.05,P＜0.01).伤照组1～14d时外周血白细胞及淋巴细胞计数均显著低于正常组和单伤组,21～28d时白细胞计数仍显著低于正常组和单伤组(P＜0.05,P＜0.01).伤照组大鼠脾脏Treg细胞仅在伤照后3d和7d高于正常组和单伤组(P＜0.01),而Th17细胞于伤照后1d即显著增高(P＜0.01),3d时升至最高,至28d时才恢复至正常组和单伤组水平.伤照组1～21d时Treg/Th17比值均显著低于正常组和单伤组(P＜0.01),至28d时恢复至正常组和单伤组水平.结论 5Gy γ射线全身照射可导致大鼠创伤愈合延迟,Treg/Th17平衡失调在其中可能发挥了重要作用.     

2 Gy γ射线照射对小鼠调节性T细胞和Th17细胞及其免疫平衡的影响

目的 观察2 Gy γ射线照射对小鼠Treg/Th17免疫平衡的影响。方法 50只C57BL/6雄性小鼠随机数字表法分为对照组和照射组,照射组小鼠接受2 Gy γ射线一次性全身照射(剂量率为164.94 Gy/min),对照组行假照射。于照射后1、3、7、14和28 d检测外周血象的变化;流式细胞仪分析外周血、胸腺及脾脏调节性T细胞(Treg细胞)和脾脏Th17细胞数量的改变。结果 受照后小鼠外周血白细胞总数和淋巴细胞数降低(t=8.89～33.54, P<0.05)。小鼠外周血Treg略有升高;胸腺Treg在照后1、3 d显著高于对照组(t=-6.45和-10.59, P<0.05),至28 d明显低于对照组(t=5.34, P<0.05);脾脏Treg在照后1～14 d显著高于对照组(t=-6.82～-3.89, P<0.05)。脾脏Th17细胞于照后1 d出现显著增高,3 d达到最大值(t=-2.42, P<0.05),较脾脏内Treg增长更为明显。Treg/Th17比值在照后1～14 d降低,差异有统计学意义(t=4.02～8.04, P<0.05),导致Treg/Th17平衡模式向Th17方向明显偏移。结论 Treg/Th17免疫平衡失调在辐射所致免疫功能损伤中可能扮演重要角色。