RNA干扰抗HBV的研究进展

RNA干扰目前已经成为生命科学领域中的一个热点。最近，一系列研究报道RNA干扰技术在体内外试验中均显著抑制HBV的蛋白表达和DNA复制，显示了该技术在治疗慢性乙型肝炎中具有巨大的应用前景。     

载体法筛选乙型肝炎病毒S基因小干扰RNA靶位体系的建立

目的 构建4个针对乙型肝炎病毒(HBV)S基因序列的小发央RNA(shRNA)表达载体，作用于增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和HBV S基因融合表达载体，观察shRNA对融合蛋白的抑制作用，筛选出有效靶位。方法 利用pAVU6 27质粒，设计并掏建4个shRNA表达载体，与融合表达载体共转染AD293细胞，荧光显做镜下观察融合蛋白的荧光表达情况并通过流式细胞仪分析shRNA对融合蛋白的抑制作用。同时，逆转录聚合酶链反应法验证其筛选的有效性。结果 成功掏建shRNA表达载体和HBs-EGFP融合表达载体；4组shRNA表达载体均可不同程度抑制融合基因的表达，其中以579位点最有效，荧光表达抑制率为69．8％，RNA水平抑制率为74．6％。结论 筛选出有效抑制HBV S基因的siRNA靶位。     

抑制HBV复制的小干扰RNA的重组腺病毒构建与鉴定

目的构建可同时表达绿荧光蛋白（GFP）和针对HBVS区基因的小干扰RNA（siRNA）的重组腺病毒,并研究该siRNA在体外对HBV的抑制作用。方法采用PCR技术自质粒pEGFP-C1中扩增含CMV启动子的GFP表达框,自质粒pAVU6＋4sh579中扩增含U6启动子的针对HBV S 区579-597位基因的siRNA表达框,分别将两个表达框克隆至穿梭载体质粒pShuttle内,与质粒pADEasy-1在大肠杆菌BJ5183内进行同源重组,将阳性重组体DNA转染至人胚肾细胞株HEK293细胞中进行包装、扩增,并在HepG2.2.15细胞中初步观察其对HBV复制的抑制疗效。结果构建了可同时表达GFP和siRNA的重组腺病毒,其可在HEK293细胞中进行包装、扩增,并在HepG2.2.15细胞中对HBV-DNA、HBsAg和HBeAg的表达具有抑制作用。结论成功构建了可同时表达GFP和针对HBV的siRNA的重组腺病毒,并在体外实验中证实了其对HBV复制具有抑制作用。     

拉米夫定联合胸腺肽α1治疗鸭乙型肝炎的效果观察

目的:探讨联合应用胸腺肽α1(Tα1)和拉米夫定对樱桃谷鸭乙型肝炎病毒(DHBV)复制的抑制作用.方法:以DHBV阳性血清感染1日龄樱桃谷鸭,制备鸭乙型肝炎模型.用拉米夫定治疗12 w后,联用Tα1治疗8 d,以拉米夫定治疗为对照组,半定量PCR法检测鸭血清中DHBV,常规病理学方法观察鸭肝组织病理变化情况.结果:和生理盐水对照组比较,拉米夫定治疗后鸭血清中DHBV水平显著降低(4483.2±5193.4 vs 9351.8±5059.6),联合Tα1治疗后抗DHBV效果更加明显(1692.2±589.2).拉米夫定治疗可减轻肝细胞变性(3.2±0.8 vs 4.6±0.5)和炎症反应程度(6.2±3.3 vs 8.6±2.8),联合Tα1治疗后肝脏炎症反应有所加强(9.0±5.2).结论:拉米夫定可抑制DHBV复制,联用Tα1抗病毒效果更好,而且有加强肝脏内免疫功能的作用.     

HBx-siRNA快速筛选体系的建立和应用

目的:建立针对HBx的小干扰RNA(siRNA)快速筛选体系.方法:①构建HBx与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)N端融合表达质粒;②用一步PCR法,制备针对HBx mRNA的RNA多聚酶启动子-siRNA表达框(SEC);③将SEC转染HBx-EGFP瞬时表达的AD293细胞,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察分析SEC对HBx-EGFP荧光表达的抑制效果,从而确定有效siRNA.结果:①成功构建HBx-EGFP融合表达质粒pHBx-EGFP,在瞬时表达细胞中,HBx-EGFP绿色荧光主要呈颗粒状,聚集在核膜与核膜外周或细胞浆;②共转染SEC能有效抑制HBx-EGFP的瞬时表达.与siHBx271相比,siHBx388是一高效siRNA位点,并且该位点与tRNAVal和H1启动子搭配更有效.结论:成功建立表达HBx的荧光蛋白报告体系,结合快速制备SEC的方法,可用于进行HBx有效siRNA及其最适搭配启动子的快速筛选.     

tRNAval-shRNA表达框在筛选HBV C基因小干扰RNA靶位中的应用

目的：以tRNA^val-shRNA表达框技术筛选高效的HBV C基因siRNA靶位。方法：针对HBV C基因序列设定5个siRNA靶位，以一步重叠延伸PCR技术生成含tRNA^val启动子的shRNA表达框（SEC），分别与HBV C基因与EGFP融合表达质粒（pC-EGFP）共转染AD293细胞，转染后48h，流式细胞术检测融合基因荧光表达情况，半定量RT-PCR法检测HBV-C基因mRNA表达水平。以筛选的shRNA表达框转染hepG2．2．15细胞，72h后放免法检测细胞培养上清HbsAg、HbeAg水平，RT-PCR检测细胞HBV pgRNA水平。结果：共转染shRNA表达框能有效抑制融合表达质粒（pC-GFP）荧光强度和HBV C mRNA表达，其中SEC-492i抑制效率最佳，而SEC-282i相对较差。选定的492i表达框（SEC-492i）及282ishRNA表达框（SEC-282i），均呈剂量依赖性抑制hepG2．2．15细胞HbeAg分泌和HBV pgRNA水平，其中SEC-492i抑制HbeAg和HBV pgRNA水平明显优于SEC-282i。结论：在选定的5个siRNA靶位中，以492i靶位RNAi效率最高。tRNA^val-shRNA表达框技术可用于抗HBV高效siRNA靶位的筛选，有进一步推广应用价值。     

基于悬浮芯片技术的56种病原微生物的高通量检测

目的:建立高通量、快速、可靠、经济的病原微生物诊断技术平台。方法:设计和合成针对56种常见病原微生物的探针和阳性对照,采用悬浮芯片技术,对56种病原微生物的阳性标准品进行检测。结果:56种标准品的检测值显著高于阴性对照,各病原微生物的阳性标准品和各探针之间无交叉反应。结论:建立了高通量、快速、可靠、经济的病原微生物诊断技术平台,为突发传染病的病原体诊断提供技术储备。     

苦参碱对人恶性黑素瘤细胞株侵袭能力及乙酰肝素酶mRNA表达的抑制作用

目的：探讨苦参碱对人恶性黑素瘤细胞株A375的侵袭能力及其乙酰肝素酶mRNA表达的影响作用。方法：A375细胞体外培养，以0．125mg／ml、0．25mg／ml和0．5mg／ml不同浓度苦参碱进行预处理48h后，采用半定量RT—PCR检测各组培养细胞HPSEmRNA表达的变化，细胞黏附实验检测细胞黏附能力的改变，Matrigel侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化。结果：和对照组比较，各浓度苦参碱处理组A375培养细胞HPSEmRNA的表达和细胞黏附侵袭能力均受到明显的抑制（P〈0．01），其抑制效应与药物的浓度呈正相关（组问比较P〈0．01）。结沦：苦参碱可能通过下调A375细胞HPSEmRNA的表达而显著抑制细胞的黏附侵袭能力，其抑制作用呈剂量依赖性。     

质粒介导的RNA干扰对AD293细胞中HBcAg表达的抑制作用

目的:研究质粒介导的RNA干扰效应对HBcAg基因表达的抑制作用.方法:设计并构建针对HBcAg基因的小发夹RNA表达载体,将构建好的shRNA表达载体和HBcAg-增强型绿荧光蛋白融合蛋白表达载体共转染人胚肾细胞株AD293,以空载体组以及针对无关序列的shRNA表达载体组为阴性对照,流式细胞术和实时荧光定量PCR法检测RNAi的抑制效果.结果:构建的特异性shRNA表达载体可以抑制HBcAg基因在AD293细胞中的表达,流式细胞仪检测抑制率可达76%,实时荧光定量PCR 法检测HBcAg基因的mRNA,抑制率可达58.6%.结论:质粒介导的RNAi可以有效抑制HBcAg基因的表达,为利用RNAi进行抗乙型肝炎病毒复制研究提供了一个可供选择的方法.     

乙酰肝素酶-siRNA表达载体的构建及其抑制黑素瘤细胞株体外侵袭能力的观察

目的 构建针对人乙酰肝素酶（HPSE）基因的小干扰RNA（siRNA）及其表达载体，观察其对A375细胞HPSE基因的干扰作用及其对肿瘤细胞体外侵袭的抑制作用。方法 设计并构建了重组质粒pRNATU6.1/HPSE-siRNA，转染A375细胞，用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法分别测定HPSE基因RNA和蛋白水平的表达变化，Matrigel侵袭实验观察A375细胞体外侵袭能力的改变。结果 将针对HPSE基因的siRNA的双链寡核苷酸片段正确克隆到pRNATU6.1载体；转染A375细胞，与对照组比较，HPSE-siRNA组HPSE基因和蛋白的表达均明显降低。转染后肿瘤细胞的体外侵袭能力与对照组相比受到明显抑制。结论 成功构建了针对HPSE基因的siRNA载体，HPSE-siRNA转染A375细胞可以显著降低细胞HPSE基因和蛋白的表达。