抗表皮生长因子受体噬菌体抗体库的构建筛选及单链抗体可溶性表达

近年来的研究表明,表皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor, EGFR) 是肿瘤治疗中一个很重要的靶点。本研究应用噬菌体展示技术筛选EGFR特异性单链抗体 (single chain Fv, scFv)。利用高表达EGFR的人鳞状上皮癌细胞A431免疫小鼠,提取脾细胞mRNA,RT-PCR扩增VH和VL基因并拼装成scFv基因。将scFv基因连接到噬菌粒pCANTAB 5E中,电击转化E.coli TG1细胞,构建了库容为2.5×10⁷的噬菌体单链抗体库。用纯化的EGFR为靶抗原对噬菌体抗体库进行5轮富集筛选,得到次级抗体库6F-10。挑取48个克隆进行ELISA测定,45个克隆为阳性。取阳性值最高的克隆感染E.coli HB2151,IPTG诱导scFv的表达。scFv (约27 kD) 以可溶形式存在于细胞质及细胞周质中,并可分泌至上清液。测序结果表明,scFv基因序列全长768 bp,编码256个氨基酸。VH为与小鼠Ig同源的重链可变区基因,VL为κ型轻链可变区基因;VH和VL均由3个抗原互补决定区和4个框架区构成。免疫印迹和细胞免疫荧光显示,可溶性scFv可分别与纯化的EGFR抗原以及细胞表面的EGFR发生特异性结合。抗EGFR特异性scFv的获得,为研制靶向EGFR的抗体药物与研究生物治疗提供导向载体分子。     

抗明胶酶单链抗体与力达霉素融合蛋白抗肿瘤作用机制及疗效研究

目的探讨抗明胶酶单链抗体Fv与力达霉素(LDM)融合蛋白的抗肿瘤作用机制及疗效。方法采用三联径向加压C4柱制备LDM发色团AE,体外分子重建将其装入融合蛋白Fv-LDP中,Superdex 75层析获得Fv-LDP-AE。反相HPLC测定纯度或相对含量。流式细胞术测定DNA含量;采用SA-β-gal染色、Western blot和细胞伤口愈合实验分别检测药物对细胞衰老、蛋白表达和迁移的影响;通过动物模型评价药物疗效。结果 Fv-LDP-AE承袭了LDM诱导肿瘤细胞周期阻滞、凋亡和裂亡的作用特点,并显示出更强的诱导衰老和抗迁移作用。Fv-LDP-AE诱导凋亡和抑制迁移依次与caspases通路激活和MMP-2降调节有关。Fv-LDP-AE可抑制小鼠和裸鼠移植瘤生长,抑制率分别可达到86.6%和82.5%。结论 Fv-LDP-AE对小鼠和裸鼠移植瘤有效,可能与其对细胞周期阻滞、凋亡、裂亡和衰老的诱导以及迁移的抑制有关。     

整合NGR肽抗EGFR单链抗体制备及其抗肿瘤活性研究

目的：利用大肠埃希菌表达基于抗表皮生长因子受体（epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR）单链抗体和靶向CD13环状NGR肽的双靶点重组融合蛋白ER（Fv）-NGR,研究其对肿瘤细胞的亲和能力和体内外抑制作用。方法：用基因工程的方法构建重组质粒pET-scfv-ngr,转入大肠埃希菌BL21,IPTG诱导表达带有His-tag标签肽的重组蛋白ER（Fv）-NGR,用Ni离子亲和柱进行纯化。运用细胞免疫荧光检测ER（Fv）-NGR与肿瘤细胞的结合;流式细胞术分析重组蛋白与肿瘤细胞的亲和力;克隆形成实验测定重组蛋白对肿瘤细胞体外增殖的抑制作用;利用人乳腺癌MCF-7裸鼠移植瘤模型对ER（Fv）-NGR的体内抗肿瘤活性进行研究。结果：重组蛋白ER（Fv）-NGR由抗EGFR单链抗体和3个连续的环状NGR肽构成,相对分子质量约为27×10^4,以包涵体形式在大肠埃希菌内表达,表达量约为5mg／L。细胞免疫荧光结果表明,重组蛋白与EGFR和CD13皆高表达MCF-7细胞有较强的结合能力,而与正常HEK293细胞结合较弱。ER（Fv）-NGR与MCF-7细胞结合的解离常数为8．4×10-7nmol／L。ER（Fv）-NGR在体外对肿瘤细胞的增殖有抑制作用,作用于MCF-7和A549细胞的Ic50值分别为1．2×10^-6和4．7×10-mol／L。在体内对人乳腺癌MCF-7裸鼠移植瘤有生长抑制作用,在10mg／kg药物剂量下28d对照组与实验组瘤体积分别为（1．06±0．17）和（0．63±0．11）cm2,F-18．7,P=0．003;瘤质量分别为（0．95±0．12）和（0．52±0．07）g,F=42．7,P〈0．001;抑瘤率为45．4％。结论：成功制备了基于单链抗体和靶向肽的双靶点融合蛋白ER（Fv）-NGR,其对肿瘤细胞具有良好的亲和力和体外增殖抑制作用,能够有效抑制裸鼠移植瘤的生长,为研制新型双靶点抗肿瘤药物提供依据。     

抗表皮生长因子受体的单链抗体ER(Fv)的构建及其抗肿瘤活性研究

 目的 利用大肠杆菌表达抗表皮生长因子受体（EGFR）的单链抗体并对其抗肿瘤活性进行研究。方法 构建含有抗EGFR单链抗体基因片段的重组质粒,IPTG诱导大肠杆菌表达单链抗体ER(Fv),用Ni离子亲和柱纯化单链抗体。ELISA测定ER(Fv)与纯EGFR抗原的结合能力;流式细胞术分析ER(Fv)与肿瘤细胞的结合;MTT法检测ER(Fv)对肿瘤细胞体外增殖的影响;动物试验测定ER(Fv)的体内抑瘤效果。结果 应用基因工程菌表达带有组氨酸标签肽 （His-tag） 的单链抗体ER(Fv),相对分子质量约为27×103,主要以包涵体形式存在,收获量约为10 mg·L-1。ELISA测定ER(Fv)与纯EGFR抗原的亲和常数为4.0×107 L·mol-1。单链抗体能与肿瘤细胞表面的EGFR发生特异性结合,其与3种EGFR高表达肿瘤细胞的解离常数皆为10-7 mol·L-1。细胞增殖实验显示,单链抗体可抑制EGFR高表达肿瘤细胞的增殖。体内抑瘤实验表明,单链抗体对人鳞状上皮癌A431裸鼠移植瘤具有中度的生长抑制作用,5,10和20 mg·kg-1 3个剂量组35 d的抑瘤率分别为43.9%、46.7%和54.8%,与对照组相比存在显著差异。结论 成功地表达了抗EGFR单链抗体ER(Fv),其对肿瘤细胞具有良好的亲和力和一定的生长抑制作用,为研制靶向EGFR的抗体药物提供基础。     

EGFR单链抗体-力达霉素融合蛋白抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖与侵袭的研究

目的 研究EGFR单链抗体-力达霉素融合蛋白ER（Fv-LDP-AE）对人乳腺癌MCF-7细胞增殖和侵袭的抑制作用,探讨其作用机制.方法 采用噻唑蓝（MTT）法测定ER（Fv-LDP-AE）对MCF-7细胞增殖的影响.流式细胞术、Hoechst 染色和Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞周期的变化以及细胞凋亡.Transwell实验测定ER（Fv-LDP-AE）对MCF-7细胞迁移和侵袭的影响.采用RT-PCR检测细胞EGFR mRNA的表达水平,Western blot分析ER（Fv-LDP-AE）对EGFR细胞信号通路的影响.明胶酶谱实验测定细胞基质金属蛋白酶（MMPs）的活性.结果 ER（Fv-LDP-AE）能显著抑制MCF-7细胞的体外增殖,其半数抑制浓度（IC50）为1.5 x10-12 mol/L.ER（Fv-LDP-AE）可引起细胞周期G2/M期阻滞,诱导细胞凋亡,抑制细胞的迁移和侵袭,阻碍EGFR的表达,干扰EGFR细胞信号通路,降低MMPs的活性.结论 ER（Fv-LDP-AE）通过抑制EGFR及其细胞信号通路、干扰细胞周期循环和诱导细胞凋亡,抑制乳腺癌MCF-7细胞的体外增殖,通过降低迁移能力和调节MMPs活性,阻碍肿瘤细胞的侵袭转移.