真菌类及其毒素在人食管癌中的病因学意义互隔交链孢霉与食管癌发生关系的研究

河南省林县为食管癌高发区,发病率之高居世界之冠,它严重地威胁着人民健康。要预防食管癌,研究食管癌病因是十分重要的。关于食管癌的病因,国外强调饮酒、吸烟、热食、亚(?)胺、微量元素缺乏、营养不足和遗传因素的作用。关于霉菌在食管癌病因学中的作用,仅南非有几篇研究粮食中霉菌毒素的报道。自从1974年我们报道了用自然发霉食物诱发大鼠食管癌     

交链孢酚单甲醚在大鼠小鼠体内的分布

对食管癌高发区粮食中分离的互隔交链孢霉的毒素交链孢酚单甲醚(AME)在大鼠、小鼠体内的分布进行研究。给动物腹腔内注射氚标记的交链孢酚单甲醚(~3H-AME),然后在不同时间测各脏器的放射性。结果表明:在所测9个脏器中,2h肝脏含量最高,食管下段在大小鼠分别居第四和第三。但大小鼠分别在72、24h则以食管下段最高,说明AME及其代谢物在此清除较慢,即对其有较高的亲和力。     

互隔交链孢霉提取物对淋巴细胞核仁形成区及细胞增殖周期的影响

本实验应用人类核仁形成区(NORs)选择性银染方法和细胞光度术,观察了互隔交链孢霉两菌株提取物261-B_2-3和C_(12)b_3-2对人淋巴细胞NORs活性的影响以及后者对细胞增殖周期移行的影响。结果显示,应用不同浓度的261-B_2-3和C_(12)b_3-2提取物处理细胞后,细胞携带Ag-NORs的染色体数明显减少,与对照组比较差异极显著(P<0.01)。表明两株提取物能明显抑制淋巴细胞NORs的活性。细胞暴露于不同浓度的C_(12)b_3-2提取物后,G_1%明显增多,S%和G_2+M%显著减少,与对照相比差异极显著(P<0.01)。说明C_(12)b_3-2提取物可能作用于G_1后期或S早期,延缓和阻滞了细胞周期的移行。     

圆弧青霉提取物诱发人羊膜细胞程序外DNA合成及合成抑制的研究

从食管癌高发区河南省林县的粮食中,分离出5株圆弧青霉(Penicillium cyclopiumWestling)用大米做培养基,25℃培养两周,经氯仿:甲醇等连续提取后,得到棕褐色膏状提取物。用其中的4株,诱发出了人羊膜FL细胞株的程序外DNA合成(Unscheduled DNA Synthesis,UDS)与DNA合成抑制(DNA Synthesis Inhibition,DSI),与溶剂对照比较,具有显著性差异(P<0.05),并在一定程度上存在剂量效应关系;加S_9后,其生物学活性明显降低,推测此提取物中含有能引起人羊膜细胞DNA损伤的直接诱变剂。     

林县互隔交链孢霉素x_4结构鉴定

从林县粮食中分离的优势菌株互隔交链孢霉培养物中提取出七种代谢物,对其中成份之一x_4,经质谱、红外光谱、核磁共振光谱测定,同时与标准品及人工合成品作比较,证明x_4成份是交链孢酚(Alternariol AOH)。     

霉菌与肿瘤发生关系的研究

一、用林县粮食中分离的黄曲霉(As-pergillus flavus Link)发霉玉米面,长期喂饲35只Wistar大鼠。最短时间87天,最长时间740天。未诱发出任何脏器的肿瘤。因而认为,此种黄曲霉对大鼠无致癌性,与林县食管癌高发病率可能无关。二、用梨孢镰刀菌[Fusarium poae(Peck)Wr.]发霉的玉米面与未经发霉处理的玉米面按1:4混合,长期喂饲Wis-tar大鼠,最短时间52天,最长282天。37只中诱发出前胃乳头状瘤27例,发生率73.0％。脐样病灶18例,发生率48.6％。膀胱鳞状上皮细胞癌1例,发生率2.7％。对照组30只大鼠,存活时间最短者89天,最长者844天。任何脏器均无肿瘤形成。三、梨孢镰刀菌培养物的致瘤成份,可能不是亚硝胺,而是一种其它的耐热物质。对大鼠前胃鳞状上皮有选择性致瘤作用,对腺胃上皮无致瘤作用。四、梨孢镰刀菌诱癌过程中,大鼠前胃的炎症反应,颇属常见,发生率为40.5％,可能与前胃肿瘤的发生是一种并发现象。     

圆弧青霉提取物的回复突变性

从河南省林县食管癌高发区采集的500份陈粮中,分离鉴定出19株圆弧青霉,以Raulin—Thom氏液体培养基培养成膜状物和菌液,分别提取两种培养物,对所得各提取物进行细菌回复突变试验。结果2株提取物使TA98、TA100检试菌株呈现诱变阳性,16株提取物使E.coli ND—160产生回复突变阳性(84.21%)。表明圆弧青霉产毒菌株广泛存在,其提取物能使检试菌遗传基因DNA产生碱基对置换和移码突变。     

互隔交链孢霉菌对甲基苄基亚硝胺合成的影响

季川等,曾报道串株镰刀菌与异戊胺共同培养,然后加入亚硝酸钠可以形成致癌的甲基异戊基亚硝胺。杂色青霉、娄地青霉、圆弧青霉也有不同程度地促进亚硝胺的合成。目前国内外尚未见到互隔交链孢霉菌能否利用甲苄胺(BZA)和亚硝钠含成甲基苄基亚硝胺(NMBZA)的报道。     

食管癌高发区严重污染主要产毒霉菌的诱变性研究

链格孢的诱变性检测:19菌株的粗提物在细菌回复突变试验和枯草杆菌DNA重组试验中阳性率分别为85.0％和84.2％,其中10株的SCE试验结果8株阳性,8株中2株同时发生染色体断裂。7个菌株的UDS和DSI试验结果6株阳性。在细胞诱变和转化试验中,D_(10)-a_2粗提粉末诱发了V_(79)细胞的突变和NIH/3T3细胞的转化。链格孢酊产毒素AME和AOH的细菌诱变试验和UDS,DSI试验结果与不同菌株粗提物的试验结果相似。 园弧青霉的诱变性检测:24株园弧青霉中4株用大米培养提取物的细菌诱变试验均阴性,但在SCE、UDS和DSI试验中均阳性。19株用Ranlin-Thom培养基培养,菌液和菌膜分别提取检测,菌液的细菌回复突变试验2株阳性,DNA重组试验13株阳性,菌膜的细菌回复突变试验15株阳性,DNA重组试验5株阳性。4株菌液与菌膜提取物的UDS与DSI试验结果与DNA重组试验结果完全一致。     

林县互隔交链孢霉素B的分离纯化研究

在测定了林县互隔交链孢霉素A的化学结构并对其致突变作用研究的基础上,我们进一步对互隔交链孢霉261株产生的毒素B组份进行了分离纯化。经TLC和硅胶柱层析纯化,获得了互隔交链孢霉素B,在二氯甲烷:甲醇:水(55:4:4)中TLC,它的Rf值为0.10。它在长波紫外光下显示黄色荧光的特性表明:它是一种荧光活性物质。经美国威斯康辛大学朱繁生教授初步鉴别,认为它与Altenuene相同,互隔交链孢霉素B对大肠杆菌ND—160具有致突变作用。