TNF-α通过ERK信号通路刺激骨髓间充质干细胞表达VCAM-1

本研究目的在于探讨TNF-α对人骨髓间充质干细胞（bonemarrowmesenchymalstemcells,BMMSC）血管细胞黏附分子．1（vascularcelladhesionmolecule1,VCAM-1）表达的影响及与ERK信号通路的关系。应用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离人BMMSC,并对其进行表面抗原表达及诱导分化鉴定。用不同浓度的TNF-α刺激BMMSC,流式细胞术检测其表面VCAM-1表达及ERK信号通路抑制剂U0126对BMMSCVCAM-1表达的影响,用Westernblot检测ERK通路活性的变化。结果表明,分离培养的BMMSC表达CD29、CD69、CD44、CDl05,不袁达CD34、CD45;BMMSC可诱导分化为成骨细胞及脂肪细胞;BMMSC膜上的VCAM-1表达随着TNF-α浓度的增加而增加;经U0126预处理后TNF-α刺激的BMMSC膜上的VCAM-1表达减少;TNF—α增加BMMSCERK信号通路的活化程度,U0126抑制TNF-α对ERK活性的作用。结论：TNF-α可能通过ERK信号通路刺激MSC表扶VCAM-1。     

RBPJ与KyoT2真核表达载体的构建与鉴定

目的：构建含有myc—RBPJ（R218H）（recombination binding protein—J）、myc—KyoT2融合基因片段的质粒，并在真核细胞中表达、鉴定。方法：由本科室保存质粒酶切分别得到RBPJ（R218H）和myc—Ky0T2基因片段，将RBPJ（R218H）基因插入载体PCMV—myc中，获得融合基因myc—RBP—J（R218H），将myc—RBPJ（R218H）和myc—KyoT2插入真核表达载体pIRES2-EGFP，构建真核表达载体myc—RBPJ（R218H）-IRES2-EGFP、myc—KyoT2-IRES2-EGFP。以其瞬时转染HEK293细胞，应用免疫印迹与流式细胞术检测融合蛋白与绿色荧光蛋白的表达。结果：正确获得myc—RBPJ（R218H）融合基因，DNA序列分析表明所构建的含myc—RBPJ（R218H）、myc—KyoT2融合基因的质粒与设计相同，myc—RBPJ（R218H）、myc—Ky0T2融合蛋白与绿色荧光蛋白均正确表达。结论：成功构建了含有myc—RBPJ（R218H）、myc—KyoT2融合基因的真核表达载体，并在真核细胞中正确表达，为进一步研究慢性粒细胞白血病与Notch信号转导通路之间的关系奠定了基础。     

小鼠CXCR4基因的克隆和慢病毒介导的表达

目的:克隆小鼠CXCR4基因并建立其慢病毒表达系统.方法:设计合成PCR引物, 从小鼠骨髓有核细胞来源的cDNA中扩增并克隆小鼠CXCR4基因的编码区.构建CXCR4-IRES-GFP表达单元后通过转染细胞, 观察GFP的表达证实其表达效能.然后建立慢病毒表达载体, 包装慢病毒后感染培养的细胞, 用流式细胞术分析其在被感染的细胞中的表达.结果:成功扩增了小鼠CXCR4基因的编码区.克隆入质粒载体后经DNA序列测定证实了其序列.通过转染细胞和流式细胞术以及荧光显微镜观察证实了CXCR4-IRES-GFP的表达效能.成功构建了CXCR4慢病毒表达载体, 感染细胞后经流式细胞术分析, 证实被感染的细胞可以表达小鼠CXCR4.结论:成功扩增、克隆了小鼠CXCR4基因, 并成功建立起其慢病毒表达系统, 为后续的基础和应用研究奠定了基础.     

再生障碍性贫血患者端粒及端粒酶活性的变化

目的观察再生障碍性贫血（aplasticanemia,从）患者外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcell,PBMC）端粒长度及端粒酶活性的变化,探讨AA的发病机制及治疗的新靶点。方法选取2010—09／2013—03月5所医院血液科确诊的71例AA患者,男性36例,女性35例,年龄12-82（39．48±18．78）岁,根据2009年英国再生障碍性贫血诊疗指南分组,其中非重型再生障碍性贫血（non-severeaplasticanemia,NSAA）组35例,重型再生障碍性贫血（severeaplasticanemia,SAA）组26例,极重型再生障碍性贫血（verysevereaplasiaanemia,VSAA）组10例。同时选取性别、年龄与之匹配的34例门诊健康体检者作为正常对照组,其中男性17例,女性17例,年龄10-73（40．68±19．00）岁。于初诊时留取外周血标本3ml。分别采用流式荧光原位杂交法（flow-fluorescenceinsituhybridization,Flow-FISH）检测PBMC端粒长度,端粒重复序列扩增技术（telomeraserepeatamplificationprotocol,TRAP）一多聚酶链式反应（poly—merasechainreaction,PCR）-酶联免疫吸附剂测定（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）法检测其端粒酶活性。结果①不同性别者外周血端粒长度无明显差别（t=0．548,P=0．585）。②外周血端粒长度与年龄呈负相关（b=-0．387,P=0．001）,不同组间比较,正常对照组端粒长度随年龄增长下降幅度要稍大于NSAA和SAA＋VSAA组,NSAA、SAA＋VSAA组端粒随年龄的变化趋势一致。③控制年龄对外周血端粒长度的影响,多重比较发现NSAA、SAA＋VSAA组外周血端粒长度均显著短于正常对照组（P均〈0．001）。④随机选取NSAA组23例,SAA＋VsAA组28例,性别年龄与之匹配的34例正常对照组检测端粒酶活性,34例正常对照组中阳性6例（17．6％）,23例NSAA组中阳性11例（47．8％）,28例SAA＋VSAA组中阳性21例（75．O％）。3诊断组外周血酶活性阳性率有统计学差别（x^2=20．555,P〈O．001）。⑤各诊断组年龄和性别对端粒酶活性无明显影响,多重比较示SAA＋VSAA组（P〈0．001）、NSAA组（P=0．002）端粒酶活性均显著高于正常对照组。结论再生障碍性贫血患者PBMC端粒长度缩短,端粒酶活性增高,端粒及端粒酶可能成为再障治疗的新靶点。     

多层螺旋CT直接下肢静脉造影的应用价值观察

目的研究分析多层螺旋CT直接下肢静脉造影的应用价值。方法选取该院收治的患有下肢静脉病症的患者,例数合计为100例,选取时间范围是2017年8月—2018年8月,将其依据随机数法分2组,50例为一组。一组给予X线下肢静脉造影,为对照组,另一组给予多层螺旋CT直接下肢静脉造影,为观察组,对比2组患者造影后的下肢静脉造影图像质量。结果观察组患者在进行多层螺旋CT直接下肢静脉造影后的造影质量优于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。结论多层螺旋CT直接下肢运用于静脉造影,其应用效果较高,值得应用。     

RBPJ与KyoT2真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建含有myc-RBPJ(R218H)(recombination binding protein-J)、myc-KyoT2融合基因片段的质粒,并在真核细胞中表达、鉴定。方法:由本科室保存质粒酶切分别得到RBPJ(R218H)和myc-KyoT2基因片段,将RBPJ(R218H)基因插入载体PCMV-myc中,获得融合基因myc-RBP-J(R218H),将myc-RBPJ(R218H)和myc-KyoT2插入真核表达载体pIRES2-EGFP,构建真核表达载体myc-RBPJ(R218H)-IRES2-EGFP、myc-KyoT2-IRES2-EGFP。以其瞬时转染HEK293细胞,应用免疫印迹与流式细胞术检测融合蛋白与绿色荧光蛋白的表达。结果:正确获得myc-RBPJ(R218H)融合基因,DNA序列分析表明所构建的含myc-RBPJ(R218H)、myc-KyoT2融合基因的质粒与设计相同,myc-RBPJ(R218H)、myc-KyoT2融合蛋白与绿色荧光蛋白均正确表达。结论:成功构建了含有myc-RBPJ(R218H)、myc-KyoT2融合基因的真核表达载体,并在真核细胞中正确表达,为进一步研究慢性粒细胞白血病与Notch信号转导通路之间的关系奠定了基础。     

梯度血清递减体外培养人脐带间充质干细胞

背景：人脐带间充质干细胞的扩增与培养条件密切相关,而含体积分数10%-20%胎牛血清的培养基可促进细胞生长。目的：建立梯度血清递减扩增培养脐带间充质干细胞的培养技术。方法：采用胶原酶Ⅱ消化分离获得脐带间充质干细胞悬液,并通过贴壁培养进行纯化,细胞贴壁后采用梯度血清递减方法,即第1代80%含血清培养基,20%无血清培养基;第2代50%含血清培养基,50%无血清培养基;第3代20%含血清培养基,80%无血清培养基;第4代100%无血清培养基。另一种传代中始终采用含体积分数10%胎牛血清的α-MEM完全培养液。用流式细胞仪检测细胞的表面标记,进行成骨诱导试验,同时与经典的含10%胎牛血清的α-MEM培养体系进行比较。结果与结论：梯度血清递减培养法与经典α-MEM培养体系所获得的细胞在扩增能力、细胞形态、免疫表型等方面相似。细胞在两种培养体系中均能保持良好的分化潜能。但梯度血清浓度法培养间充质干细胞可使用更少量胎牛血清,提高临床应用安全性。     

骨髓间充质干细胞抑制再生障碍性贫血患者外周血T细胞增殖的实验研究

背景:既往研究发现骨髓间充质干细胞具有免疫抑制作用,而再生障碍性贫血患者存在T淋巴细胞异常活化及增殖。目的:体外分析骨髓间充质干细胞对再生障碍性贫血患者外周血T淋巴细胞增殖的抑制作用。方法:分离再生障碍性贫血患者外周血T淋巴细胞,行羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFDASE)荧光染色,与体外培养扩增的骨髓间充质干细胞按3︰1比例直接接触法及Transwell法共培养,加入植物血凝素(PHA)刺激T淋巴细胞增殖,并设阴性及阳性对照。流式细胞术检测各组T细胞增殖情况,评价骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞增殖的影响。结果与结论:CFDASE染色分析显示,直接接触组T细胞增殖较阳性对照组明显减低(P<0.01);Transwell组T细胞增殖亦较阳性对照组减低(P<0.05);直接接触组T细胞增殖较Transwell组明显减低(P<0.01)。骨髓间充质干细胞可能通过直接接触及分泌某些细胞因子方式抑制再生障碍性贫血患者异常增殖的T细胞,以直接接触方式发挥主要作用。     

32层螺旋CT增强扫描中高压注射器的应用与护理体会

目的 了解高压注射器的使用方法.方法 对240例患者应用高压注射器进行CT增强扫描.结果 所有患者均获得高质量、高清晰度的图像,为临床诊断及治疗提供强有力的依据.结论 高压注射器的应用满足了多层螺旋CT对造影剂输注的更高要求,使CT的成像质量达到了一个新的高度.     

梯度血清递减体外培养人脐带间充质干细胞

背景：人脐带间充质干细胞的扩增与培养条件密切相关,而含体积分数10%~20%胎牛血清的培养基可促进细胞生长。 目的：建立梯度血清递减扩增培养脐带间充质干细胞的培养技术。 方法：采用胶原酶Ⅱ消化分离获得脐带间充质干细胞悬液,并通过贴壁培养进行纯化,细胞贴壁后采用梯度血清递减方法,即第1代80%含血清培养基,20%无血清培养基;第2代50%含血清培养基,50%无血清培养基;第3代20%含血清培养基,80%无血清培养基;第4代100%无血清培养基。另一种传代中始终采用含体积分数10%胎牛血清的α-MEM完全培养液。用流式细胞仪检测细胞的表面标记,进行成骨诱导试验,同时与经典的含10%胎牛血清的α-MEM培养体系进行比较。 结果与结论：梯度血清递减培养法与经典α-MEM培养体系所获得的细胞在扩增能力、细胞形态、免疫表型等方面相似。细胞在两种培养体系中均能保持良好的分化潜能。但梯度血清浓度法培养间充质干细胞可使用更少量胎牛血清,提高临床应用安全性。