用SYBR-Green Ⅰ实时荧光PCR结合融解曲线分析法诊断α-地中海贫血

目的建立自动化、高通量、准确快速检测缺失型α-地中海贫血基因型的技术。方法应用SYBR-Green1进行两个实时荧光聚合酶链反应(real-time fluorescence polymerase chain reaction with SYBR-Green1,SYBR-PCR),检测左缺(-α4.2)、右缺(-α3.7)等位基因,同时进行融解曲线(dissociation curve,DC)和Tm(melting temperature)值分析。PCR产物重组到pCR2.1,重组子梯度稀释作为模板检测灵敏度,确定两种等位基因型(-α4.2,-α3.7)的检测下限,并对110份DNA样品进行检测。结果检测-α4.2和-α3.7的PCR产物长度分别为1.65kb、1.9kb,Tm分别为(81.5±0.5)℃、(82.5±0.5)℃,检测下限分别为9×102个拷贝、4.3×102个拷贝。该检测技术的灵敏度较常规PCR结合琼脂糖凝胶电泳法高10倍。结论SYBR-Green1实时荧光PCR结合融解曲线分析及Tm分析可以灵敏、准确地检测-α4.2、-α3.7、αα(包括αTα)及--SEA4种等位基因,从而为各种缺失型α-地中海贫血做出基因诊断。该技术具有自动化程度高,不需荧光标记探针,成本低,易质控,防污染,高通量等优点,适于临床推广应用。     

SYBR-Green I实时荧光聚合酶链反应结合融解曲线分析技术在α-珠蛋白生成障碍性贫血基因诊断中的应用

目的 探讨SYBR-Green I实时荧光PCR(SYBR-PCR)结合融解曲线分析(D.C)技术进行α-珠蛋白生成障碍性贫血(α-地贫)基因诊断的价值.方法 对22个家系中的37份样品采用4管SYBR-PCR结合D.C进行--SEA、-a3.7、-α4.2及非缺失型(αα)4个等位基因型的检测,进而作出基因诊断.同时运用单管多重PCR(mPCR)结合凝胶电泳技术进行基因检测加以对照确认.结果 22个家系中6个家系检出有--SEA或-α3.7携带者,其中东南亚型缺失携带者(--SEA/αα)7例,右侧缺失携带者(-α3.7/αα)3例,东南亚型缺失与右侧缺失双重杂合子(--SEA/-α3.7)1例.2例为胎儿产前诊断.其中1例为Bart's水肿胎儿(--SEA/--SEA),另1例为东南亚型缺失携带者(--SEA/αα).用mPCR凝胶电泳技术得出的基因诊断结果与上述结果一致.结论 SYBR-PCR结合D.C技术在α-地贫的基因诊断、携带者检出及产前诊断方面具有实用价值.     

单纯疱疹病毒I型糖蛋白D酵母表达载体的构建

目的:构建含有单纯疱疹病毒I型包膜糖蛋白D全基因片段的克隆载体及酵母表达载体,为进一步真核表达重组gD蛋白奠定基础。方法:应用PCR方法从HSV-I基因组中扩增糖蛋白D的全长基因,产物回收后与pMD-18T载体连接,并转化,经氨苄筛选及测序,建立克隆载体pMD18T-gD;克隆载体与表达载体双酶切后,产物连接、转化大肠杆菌JM109,筛选、测序后确定构建了酵母表达载体pGAPZαA-gD。结果:重组质粒pMD18T-gD和pGAPZαA-gD经PCR和酶切均出现相应长度的片段,测序结果证实为gD基因,序列分析同源性为99.66%。结论:成功构建了含有单纯疱疹病毒I型糖蛋白D全基因的克隆载体及酵母表达质粒。     

实时荧光聚合酶链反应结合融解曲线分析在α-地中海贫血基因诊断中的价值

目的建立自动化、高通量、准确快速检测缺失型α地中海贫血基因型的技术。方法运用SYBRGreen1和ABI7000热循环仪分别进行3个实时荧光定量聚合酶链反应(SYBRQPCR),同时进行融解曲线(D.C)和Tm值分析,根据特定Tm值对应的D.C峰值判定基因型,即以该峰值≥Cutoff值定为PCR结果阳性。将PCR产物重组到T载体,筛选到含正确扩增片段的克隆,以梯度稀释重组质粒DNA为模板,进行SYBRQPCR得出标准曲线。从而定量未知标本。结果优化了3个SYBRQPCR反应的引物及其浓度,热循环条件等。检测SEA等位基因的PCR产物长800bp,Tm=82.5℃±1℃。αα等位基因的PCR产物长206bp,Tm=83.0℃±1℃。非SEA等位基因的PCR产物长436bp,Tm=84.0℃±1℃。重组质粒拷贝数在1至105范围内,其对数值与CT值均呈良好线性关系。该检测技术的灵敏度较常规PCR结合琼脂糖凝胶电泳法高出16倍以上。联合运用3个SYBRQPCR反应可以为SEA缺失携带者、缺失型HbH病、非缺失型HbH病、α地贫2纯合子、Bart′s水肿胎儿综合征做出基因诊断,并可用于产前诊断。结论该技术具有自动化程度高、不需荧光标记探针、成本低、易质控、防污染、高通量等优点,适于临床推广应用。     

多氯联苯暴露与乳腺癌发病关系的研究进展

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,其发病机制复杂。体外实验表明多氯联苯(PCBs)能激活雌激素相关的信号通路诱导靶基因表达,促进乳腺细胞增殖并抑制其凋亡,最终导致肿瘤的发生和发展。然而就PCBs暴露是否增加乳腺癌发病风险的流行病学研究结果存在不一致。本文就PCBs使用概况,PCBs暴露与乳腺癌可能存在的联系,相关人群流行病学研究以及PCBs暴露促进乳腺癌发生的可能机制作一综述。     

木贼麻黄多糖的提取及体外抗氧化活性研究

目的 优化木贼麻黄多糖的提取工艺,初步研究木贼麻黄多糖的体外抗氧化活性。方法 采用热水浸提法提取木贼麻黄多糖,利用单因素试验结合响应面法对提取条件进行优化,并研究木贼麻黄多糖的体外抗氧化活性。结果 木贼麻黄多糖的最佳提取条件为：提取时间2.5 h,提取温度73℃,液料比25∶1,在此条件下多糖提取率为（5.57±0.072）%。木贼麻黄多糖对DPPH自由基和羟基自由基具有较强的清除能力,IC₅₀分别为703.9 μg·mL^-1和2 135.1 μg·mL^-1;对超氧阴离子自由基具有一定的清除能力,对Fe³⁺有一定的还原能力。结论 该提取工艺能较好地提取木贼麻黄多糖,所得木贼麻黄多糖具有一定的体外抗氧化能力,但活性低于同浓度的维生素C。     

用变性高效液相色谱检测和脱氧核糖核酸测序方法对三个肥厚型心肌病家系β肌球蛋白重链基因突变的分析结果

目的:研究家族性肥厚型心肌病(HCM)的主要致病基因β肌球蛋白重链(MYH7)基因突变情况.方法:用变性高效液相色谱(DHPLC)检测和脱氧核糖核酸(DNA)测序方法对三个肥厚型心肌病家系成员的MYH7基因8、14外显子及附近上下游序列进行检测分析;另选正常对照者50例.结果:三个家系其中一个家系发现MYH7基因14外显子中存在Thr441Met突变,外显子8也存在一个点突变.另外两个家系均存在外显子8的C到T的突变,但表型不一.其中一个家系还存在内含子13和19的多态位点.此外,三个家系MYH7基因第3外显子均发现同义突变.结论:MYH7基因在肥厚型心肌病家系中具有较高的突变率.运用变性高效液相色谱技术,能够快速有效的进行基因突变筛查.     

重组抗原在HSV-Ⅰ感染ELISA检测中的应用

目的　用单纯疱疹病毒(HSV)重组蛋白作为包被抗原建立一种特异性和灵敏性较高的ELISA方法。方法　将重组糖蛋白D(gD)和HSV Ⅰ分别作为包被抗原,检测5 7份临床标本,同时用国产和德国试剂盒进行检测;将德国试剂盒作为金标准,另外三者检测结果在特异性、灵敏性和符合率等方面与其进行比较。结果　与德国试剂盒相比,在特异度、敏感度、符合率方面,重组抗原分别为5 7 1%、82 0 %、78 9%。病毒抗原分别为5 7 1%、78 0 %、75 4 % ;国产试剂盒分别为10 0 0 %、4 8 0 %、5 4 4 %。重组蛋白重复性实验结果经统计学处理差异无统计学意义(P >0 0 5 )。结论　用酵母菌表达的HSV Ⅰ重组gD蛋白作为包被抗原进行ELISA检测是一种敏感、特异的方法,具有较大的应用价值。     

雷公藤甲素亚慢性中毒对昆明种小鼠肾脏及睾丸的影响

为了观察雷公藤甲素肾脏及睾丸的毒性影响,80只昆明小鼠随机分成3个实验组和1个对照组。60d内3个实验组的小鼠每48h腹腔注射雷公藤甲素一次（A组0.025mg/kg,B组0.05mg/kg,C组0.1mg/kg）。结果显示肾脏病变除肾小管上皮细胞变性、坏死外,肾小管管腔内出现蛋白管型,最后处死的所有实验组动物的90％以上肾小球囊壁壁层上皮不同程度地增生,BUN检测结果表明,B组和C组均显著性升高（P<0.05）,提示有发展成肾功能衰竭的趋势。说明甲素对小鼠的肾损害可能是亚慢性中毒者的主要死亡原因之一。睾丸病变明显,表现为睾丸萎缩,脏器系数降低,各级生精细胞变性、坏死,数量减少,其中以精子、精子细胞和次级精母细胞最敏感,实验结果还表明甲素对睾丸具有蓄积毒性。提示雷公藤在抗生育作用中,甲素起着非常重要的作用。