抑制人BI-1基因表达shRNA重组慢病毒表达载体的构建

背景: 慢病毒介导的RNAi技术以其专一性、抑制效率高、作用持久等优点已广泛应用于基因功能研究中.该技术病毒包装、转染、以及shRNA序列设计都会对抑制效率产生影响.因此实验以人的Bax抑制子1 (BI-1)为目的基因进行RNA干扰实验来探讨其影响因素.目的:为了利用慢病毒Lentivirus介导的RNAi技术寻找抑制人BI-1基因表达的siRNA.设计、时间及地点:单一样本观察,于2007-09/2008-12在北京大学医学部基础医学院医学遗传学系完成.材料:293T细胞、SH-SY5Y细胞为实验室保存;用Ambion公司(www.ambion.com)提供的网络在线工具设计了4个shRNA.方法:构建带有绿色荧光蛋白(EGFP)标签的、针对人BI-1基因不同区域设计的shRNA重组表达载体,然后与包装蛋白表达载体共转染293T细胞以包装成4种shRNA病毒粒子.通过流式细胞仪检测GFP的表达情况来摸索最佳包装条件.Real-time PCR以β-肌动蛋白mRNA被用作内参,将4种重组病毒和对照组病毒上清液侵染SH-SY5Y,检测内源性BI-1基因的敲低效率,筛选到最佳RNAi有效序列.主要观察指标:被不同包装病毒侵染的细胞内GFP的表达率.结果:pLentiLox3.7、rev、vsvg、rre等4质粒包装系统的最佳包装比例为2∶1:1∶1,包装48 h收获的病毒粒子的感染效率最高,并且在包装后的24 h之后换液会提高包装效率.靶定到人BI-1基因-2-17核苷酸(起始编码区域)的shRNA RNA干扰效率最高.能够抑制40%正常基因表达.结论:实验摸索出Lentivirus介导的RNAi技术病毒包装的重要影响因素.为建立稳定的人BI-1基因表达敲低的神经细胞模型和研究BI-1异常表达参与的神经元凋亡疾病的病理研究打下基础.     

抑制人BI-1基因表达shRNA重组慢病毒表达载体的构建

背景: 慢病毒介导的RNAi技术以其专一性、抑制效率高、作用持久等优点已广泛应用于基因功能研究中。该技术病毒包装、转染、以及shRNA序列设计都会对抑制效率产生影响。因此实验以人的Bax抑制子1 (BI-1)为目的基因进行RNA干扰实验来探讨其影响因素。 目的：为了利用慢病毒Lentivirus介导的RNAi技术寻找抑制人BI-1基因表达的siRNA。 设计、时间及地点：单一样本观察,于2007-09/2008-12在北京大学医学部基础医学院医学遗传学系完成。 材料：293T细胞、SH-SY5Y细胞为实验室保存;用Ambion公司(www.ambion.com)提供的网络在线工具设计了4个shRNA。 方法：构建带有绿色荧光蛋白(EGFP)标签的、针对人BI-1基因不同区域设计的shRNA重组表达载体,然后与包装蛋白表达载体共转染293T细胞以包装成4种shRNA病毒粒子。通过流式细胞仪检测GFP的表达情况来摸索最佳包装条件。Real-time PCR以β-肌动蛋白mRNA被用作内参,将4种重组病毒和对照组病毒上清液侵染SH-SY5Y,检测内源性BI-1基因的敲低效率,筛选到最佳RNAi有效序列。 主要观察指标：被不同包装病毒侵染的细胞内GFP的表达率。 结果：pLentiLox3.7、rev、vsvg、rre等4质粒包装系统的最佳包装比例为2∶1：1∶1,包装48 h收获的病毒粒子的感染效率最高,并且在包装后的24 h之后换液会提高包装效率。靶定到人BI-1基因-2-17核苷酸(起始编码区域)的shRNA RNA干扰效率最高。能够抑制40%正常基因表达。 结论：实验摸索出Lentivirus介导的RNAi技术病毒包装的重要影响因素。为建立稳定的人BI-1基因表达敲低的神经细胞模型和研究BI-1异常表达参与的神经元凋亡疾病的病理研究打下基础。     

肿瘤型旋转铰链式人工膝关节置换术后脱位的原因分析与治疗

目的 通过对肿瘤型旋转铰链膝关节置换术后脱位的病例进行回顾性分析,探讨术后脱位发生的原因和治疗方法.方法 回顾性分析从2004年11月至2009年11月收治的8例肿瘤型旋转铰链膝关节置换术后脱位患者的临床资料：其中男性4例,女性4例,平均年龄23.8岁（16～41岁）,均为原发性骨肿瘤,病理类型为骨肉瘤6例,恶性纤维组织细胞瘤1例,纤维肉瘤1例.包括股骨下段肿瘤6例,胫骨上段肿瘤2例.平均截骨长度为14.6cm.手术入路选择膝关节内侧入路,对于胫骨上端肿瘤患者,我们术中均游离腓肠肌内侧头覆盖于假体前方,将之与周围的肌肉筋膜缝合固定,以改善局部软组织覆盖.所选用旋转铰链式膝关节假体旋转套筒长度为22.5mm （5例）和37mm （3例）.结果 术后脱位时间为平均9.3个月（10天至2年）,5例患者发生1次脱位,3例患者发生2次脱位.发生脱位后1例在麻醉下手法复位成功,7例患者最终行切开复位和（或）假体翻修术.发生脱位的患者均在手术后膝关节获得稳定.功能评价：应用MSTS 93 （musculoskeletal tumor society score 93,MSTS 93）评分系统评价膝关节功能.脱位前膝关节功能评分为64.5%±15.2%,复位术后为67.2%±15.9%.脱位前与翻修术后功能相比,差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 术后脱位的原因主要有三点,分别为假体设计、肌肉及软组织张力不足、术后膝关节不合理康复锻炼.我们认为,通过改进假体设计如增长旋转套筒长度及加装防脱位装置等,执行有循证医学证据的术后功能康复计划、避免膝关节过屈等动作以预防脱位的发生.经切开复位及翻修术可获得膝关节稳定,并恢复患肢功能.