人CD80基因的重组真核表达载体的构建及其在体内外的表达

构建了人ＣＤ８０ｃＤＮＡ重组真核表达载体ＰＣＤ－ＣＤ８０，并将这一重组表达载体用脂质体介导的基因转移技术转染至体外培养的小鼠黑素瘤Ｂ１６细胞系，并经直接注射浆裸露ＤＮＡ导入小鼠肌肉组织。     

内质网应激介导过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡

目的探讨氧化应激诱导心肌细胞凋亡是否与内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)的调控机制有关。方法给予乳鼠心肌细胞高低两种浓度(500、100μmol/L)和不同时间(0、4、8、12、24h)过氧化氢(H2O2)刺激。采用流式细胞仪检测各组心肌细胞的凋亡率;苏木精-伊红染色法(HE)观察心肌细胞凋亡的典型形态;通过Western blot检测ERS标志蛋白p-PERK和CHOP的表达变化。进一步采用ERS抑制剂化学伴侣PBA(4-phenylbutyric acid)抑制心肌细胞ERS,Western blot检测p-JNK、p-PERK和CHOP蛋白的表达变化;采用流式细胞仪检测Caspase-12和Caspase-3的活性。结果①低浓度H2O2可显著诱导心肌细胞凋亡,高浓度H2O2则导致心肌细胞发生坏死;100μmol/L H2O2刺激心肌细胞8h时其凋亡率最高。②心肌细胞发生凋亡时ERS标志蛋白p-PERK和CHOP表达显著增高。③ERS抑制剂PBA预处理心肌细胞,可有效抑制H2O2诱导的p-PERK、CHOP表达及Caspase-3、Caspase-12活性的上调,与单纯H2O2处理组相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论低浓度H2O2可通过促发ERS整合调控机制介导心肌细胞凋亡。这一结果将从ERS整合调控细胞应激的角度为心血管疾病的防治提供新思路。     

NS398对白血病细胞K562凋亡的时间和剂量效应机制

目的 探讨非甾体药物选择性环氧合酶-2(COX-2)抑制剂NS398对白血病细胞株K562细胞增殖及凋亡的效应关系和机制.方法 采用噻唑蓝还原法(MTT法)检测NS398对K562细胞增殖抑制作用,流式细胞仪(FCM)和单细胞凝胶电泳技术(comet assay)测定K562细胞的凋亡,免疫印迹实验检测相关蛋白的表达.结果 NS398抑制K562细胞增殖存在时间和剂量效应关系,各浓度间差异有显著性(P<0.05).NS398激活caspase-3和caspase-9,促进P53蛋白的积聚、Bax蛋白表达的上调和Bcl-xL蛋白表达的下调,进而导致细胞色素C的释放,致使K562细胞凋亡.结论 NS398可抑制K562细胞增殖,其诱导细胞凋亡的途径可能经过P53介导Bax的Caspase-3、Caspase-9的激活,揭示COX-2抑制剂可能存在着一个影响细胞翻译的新机制.     

B7-CD28/CTLA4共刺激旁路的组成、功能及其在肿瘤基因治疗中的应用

B7-CD28/CTLA4共刺激旁路组成复杂,功能重要,对此共刺激旁路的探索将有助于更好地了解机体的免疫调控及免疫监视;B7分子的肿瘤基因疗法,尤其是B7分子联合其它免疫刺激分子的基因疗法是目前肿瘤基因治疗的热点和方向,并已在临床应用中获得成功,本文就此几方面作一介绍。     

转染人CD80基因的黑色素瘤细胞生长特性及免疫原性探讨

】 ObjectivesTo investigate the effects of the CD80 costimulatory molecule expression on the immunogenicity and biological characteristics of poorly immunogenic B16 melanoma cells,explore the relationship between the immunogenicity of tumor cells and cell surface molecules. MethodsHuman CD80 cDNA was transfected into B16 melanoma cells by lipofectin-mediated gene transfer before the expansion of tumor cells were tested by MTT method in vitro;C57BL/6 mice were inculated subcutaneously either mock-transfected B16 cells (B16-neo)or CD80-transfected B16 cells (B16-CD80),then the latency,survival times and tumor mass growth were investigated.The lymphocytes were examined for both proliferation indices (PI) and specific cytotoxic activity by MTT method and improved LDH-releasing method,after syngenic Mixed Lymphocyte tumor cultures (MLTCs). ResultsIn the B16-CD80 cells,in which CD80 expression were detected by SABC method, demonstrated slower growth rate than B16-neo Clles in vivo (P<0.05),though they didn't in vitro. Compared with B16-wt and B16-neo cells,B16-CD80 cells more effectively induced the proliferation of effector lymphocytes and the generation of specific lytic activity against B16-wt cells. ConclusionsThe CD80 (B7-1) expression in poorly immunogenic tumor cells can increase their immunogenicity and decrease their tumorigenicity,the effects are associated with the expression of ICAM-1 and MHC molecules on tumor cells surface.     

人CD80基因的cDNA克隆及其在肿瘤细胞中的表达

采用巢式PCR(nested PCR)的方法从Raji细胞中扩增出人CD80 cDNA,并将这一cDNA克隆入载体pUC19中。经PCR扩增和限制性酶切分析,进行初步鉴定后,再将人CD80 cDNA克隆到pcD-NA表达载体上,构建成为pCD-CD80重组质粒。应用脂质体介导的基因转移技术将这一表达载体导入小鼠黑色素瘤B16细胞后,用SABC法进行瞬时表达的检测。结果表明,转染后48h就具有明显人CD80基因的表达产物。     

RhoC GTP酶的表达与宫颈癌侵袭和转移的关系

目的 研究RhoC GTP酶的表达及其与宫颈癌侵袭和转移的关系.方法 半定量RT-PCR法和免疫组化方法分别检测正常宫颈组织、宫颈上皮内瘤样变(CIN)组织和宫颈癌组织中RhoC基因mRNA和蛋白的表达;半定量RT-PCR法和Western blot分别检测人宫颈癌细胞株SiHa、HeLa和C33a中RhoC mRNA和蛋白的表达,基质胶粘附实验、Transwell体外侵袭实验和迁移实验分别比较3株宫颈癌细胞的粘附率、侵袭能力和运动能力.结果 RhoC的mRNA和蛋白表达在正常宫颈组织、CIN组织和宫颈癌组织中逐渐增高,在宫颈癌组织中的表达明显高于CIN组织;RhoC在C33a细胞中的表达明显低于SiHa和HeLa细胞,C33a细胞对细胞外基质的粘附率、体外侵袭能力和运动能力明显低于其它2种细胞.结论 宫颈癌组织中,RhoC GTP酶的表达与宫颈癌的进展和淋巴结转移有关;在宫颈癌细胞中,RhoC GTP酶的表达与细胞的粘附能力、侵袭能力和运动能力呈正相关.     

RIZ1基因表达缺陷对结肠癌细胞增殖凋亡的影响

目的 观察抑癌基因Rb结合锌指结构基因(RIZ1)表达缺陷对结肠癌细胞增殖和凋亡能力的影响.方法 以表达RIZ1的LoVo细胞和不表达RIZ1的SW480细胞作为研究对象,采用甲基化特异性PCR(MSP)法检测2株结肠癌细胞的RIZ1基因启动子的甲基化状况;以3×105/瓶为细胞观察单位,5 μmol/L的5-杂氮2'-脱氧胞苷(5-aza-CdR)对细胞进行去甲基化处理48 h,用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot分别检测RIZ1的mRNA和蛋白表达,观察处理前后的差异;细胞增殖实验和流式细胞仪分别检测细胞的增殖和凋亡.结果 在SW480细胞中可以扩增出RIZ1基因启动子的甲基化条带,经去甲基化处理后,则能检测出该基因的mRNA和蛋白的表达条带,其增殖速度明显减慢,凋亡率从(4.4±1.7)%增高到(23.8±2.6)%,差异有统计学意义(P＜0.05),5 μmol/L的5-aza-CdR可显著上调SW480中RIZ1的表达;而LoVo细胞中未检测到基因启动子的甲基化,处理前后其基因表达、增殖和凋亡差异均无统计学意义(P＞O.05).结论 抑癌基因RIZ1启动子异常甲基化在调节其表达中发挥重要作用,对RIZ1进行去甲基化处理使其重新表达能明显减缓结肠癌SW480细胞的生长,促进其凋亡.     

人CD80基因的cDNA克隆及其在肿瘤细胞中的表达

采用巢式ＰＣＲ的方法从Ｒａｊｉ细胞中扩增出人ＣＤ８０ ｃＤＮＡ，并将这一ｃＤＮＡ克隆入载体ｐＵＣ１９中，经ＰＣＲ扩增和限制性酶切分析，进行初步鉴定后，再将入ＣＤ８０ｃＤＮＡ克隆到ｐｃＤＮＡ表达载体上，构建成ｐＣＤ－ＣＤ８０重组质粒。应用脂质本介导的基因转移技术将这一表达载体导入小鼠黑色素瘤Ｂ１６细胞后，用ＳＡＢＣ法进行瞬时表达的检测。结果表明，转染后４８ｈ就具有明显人ＣＤ８０基因的表达产物。