多西紫杉醇/顺铂/5-氟脲嘧啶联合治疗进展期胃癌的近期疗效观察

目的 了解多西紫杉醇加顺铂及5-氟脲嘧啶(5-Fu)的联合化疗方案治疗进展期胃癌患者的疗效和毒副作用.方法 对35例进展期胃癌采用以下化疗方案:多西紫杉醇75 mg/m2,第1天;顺铂25 mg/m2,第1～3天;5-Fu 500 mg/m2,第1～5天.每3周为1个周期,至少2个周期.观察化疗后肿瘤原发病灶的缓解情况,并观察化疗的毒副反应.结果 临床有效率为51.4%,其中完全缓解(CR)占8.6%(3例),部分缓解(PR)占42.9%(15例),疾病稳定(SD)占34.3%(12例),疾病进展(PD)占14.3%(5例).毒副反应主要为白细胞减少、恶心、呕吐、腹泻、脱发.共有8例发生了Ⅲ～Ⅳ度的白细胞减少,但未见因此而发生的败血症和死亡病例.结论 多西紫杉醇加顺铂及5-Fu的化疗方案治疗进展期胃癌,近期疗效明显,且患者耐受性良好.     

一种高效逆转录病毒载体pSIV-1的构建及其功能的初步鉴定

构建高效的逆转录病毒载体pSIV-1,并对其功能进行初步鉴定。对pEGZ-Term、pLXSN、pGEX-5X-3等各类表达载体的调控元件进行分析后,运用分子生物学手段去除表达载体pEGZ-Term中的部分元件,定向插入启动子SV40、选择性标志G418、多克隆酶切位点等,从而获得一种新型逆转录病毒载体pSIV-1。运用新载体构建含人PD-L1基因片段的重组载体,并用脂质体转染法,将其转染至包装细胞系293T。收集含重组病毒的上清转染L929细胞,用含G418的培养液筛选,成活细胞经流式细胞仪检测到目的蛋白后,扩大培养,从而获得L929/PD-L1基因转染细胞。L929/PD-L1基因转染细胞与活化T细胞体外混合培养,观察PD-L1信号对T细胞活化后表达CD25、CD69的影响。结果,成功构建了pSIV-1逆转录病毒载体;酶切图谱分析与理论值一致;基因转染细胞能持续稳定高表达PD-L1,筛选时间较短,感染效率较高;PD-L1基因转染细胞能显著抑制T细胞的进一步活化。因此构建成一种新型高效逆转录病毒载体pSIV-1,为构建基因转染,并开展相关功能学研究奠定了良好的物质基础。     

人PD-L1Ig融合蛋白的表达及其生物学活性的研究

为获取人PD L1Ig融合蛋白 ,研究其对T细胞的调节效应 ,采用PCR法从pMD18 T/PD L1中扩增出人PD L1基因的胞外段序列 ,从人脾脏细胞中扩增出人IgG1Fc恒定区基因 ,两者拼接后插入逆转录病毒载体pEGZ Term ,用脂质体法与两个辅助病毒载体共转染 2 93T包装细胞 ,用含病毒颗粒的培养上清反复感染L92 9细胞 ,Zeocin筛选能稳定分泌人PD L1Ig蛋白的基因转染细胞并亚克隆之 ,经无血清培养 ,收集的上清用Dotblot检测、ELISA定量后 ,浓缩并经ProteinG柱纯化 ,再经Westernblot鉴定。以FACS分析纯化蛋白对活化T细胞表达的PD 1结合能力 ,以体外T细胞活化体系观察其对T细胞表型的调节作用。结果表明 ,成功地构建了表达人PD L1Ig蛋白的重组逆转录病毒载体 ;获得的L92 9/PD L1Ig细胞能稳定分泌人PD L1Ig蛋白 ;该蛋白与PD 1受体具有良好的结合能力 ,能抑制T细胞的进一步活化。     

人B7-H4基因转染细胞的构建及其对T细胞的共刺激效应的初步研究

目的 构建含有人B7-H4基因的重组逆转录病毒载体，获得稳定表达B7-H4基因的1929细胞并初步研究其对T细胞的共信号作用及可能机制。方法从含人B7-H4基因的cDNA序列FLJ22418中，采用PCR扩增出B7-H4全长基因，双酶切装入逆转录病毒载体pEGZ-HA-Term，与辅助病毒载体脂质体法共转染包装细胞293T，用其培养上清感染1929细胞72h后，经Zeocin筛选出稳定表达B7-H4蛋白的L929细胞株；采用免疫荧光标记和流式细胞仪分析免疫分子的表达、^3H-TdR掺入检测细胞增殖以及ELISA测定细胞因子的水平。结果构建了含人B7-H4基因的重组逆转录病毒载体和获得含有B7-H4基因的重组病毒，筛选获得能稳定高表达人B7-H4蛋白的I_929转基因细胞；该转基因细胞对T细胞体外具有抑制增殖、活化和细胞因子分泌的作用。结论构建了稳定表达人B7-H4蛋白的细胞株，B7-H4分子在体外通过抑制T细胞分泌IL-2和促进其凋亡作用可显著地下调T细胞功能的效应。     

两株新的鼠抗人OX40L单克隆抗体的研制及其生物学功能的初步研究

目的:鼠抗人OX40L分子功能性单克隆抗体(mAb)的研制及其生物学特性的鉴定。方法:以高表达人OX40L分子的基因转染细胞L929/OX40L为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,经流式细胞术(FCM)分析和多次克隆化培养,筛选出特异分泌鼠抗人OX40L分子mAb的杂交瘤细胞株;采用Westernblot、Ig亚型快速定性试纸法、染色体核型分析、竞争结合抑制试验、间接免疫荧光法和MTT增殖试验等对单抗的生物学特性进行鉴定。结果:获得2株持续、稳定分泌鼠抗人OX40LmAb的杂交瘤细胞株,分别命名为4D6和5C2。对mAb生物学功能的研究结果表明,2株mAb均能识别成熟DC细胞以及Jurkat、SHI-1、U937等白血病细胞株表面的OX40L分子。对其中SHI-1白血病细胞株增殖影响的实验显示,这2株抗体对SHI-1的增殖都具有一定的抑制作用。结论:成功地获得了2株鼠抗人OX40L功能性mAb杂交瘤,其所分泌的抗体能特异地识别人OX40L分子,并影响表达OX40白血病细胞株的体外增殖,为进一步研究OX40/OX40L的生物学功能奠定了基础。     

人OX40L在BL-21大肠杆菌中的表达和生物学功能研究

目的：克隆和表达人可溶性OX40L重组蛋白(sOXdOL)，探讨OXdOL信号在T细胞对乳腺癌细胞反应中的协同刺激效应。方法：运用基因工程技术在大肠杆菌中表达人重组融合蛋白GST-sOX40L，Western blot分析表达蛋白的特异性；采用体外T细胞和乳腺癌细胞混合培养体系，观察对T细胞生长和增殖的影响。结果：构建了GST-sOX40L原核表达体系，从而进行重组蛋白的有效表达；纯化的重组蛋白通过免疫印迹分析能被特异性单抗识别，并在体外培养体系中显示出协同刺激T细胞对乳腺肿瘤细胞的反应性：促进T细胞生长、增殖以及IL-2的分泌。结论：成功地研制了具有生物学活性的sOX40L，为体外激发肿瘤特异性T细胞提供良好的物质基础。     

化疗引起肿瘤患者血糖代谢异常机制的初步探讨

目的通过检测恶性肿瘤患者在化疗不同时期的血糖、胰岛素和C肽水平,观察化疗对糖代谢的影响,并对其机制作初步探讨。方法 94例恶性肿瘤患者均非胰腺癌或肝细胞癌,也无糖尿病史。其中66例获得了单次化疗前后的血糖、胰岛素和C肽水平的对照值;17例获得多次化疗前后的对照值。对所有患者化疗前的血糖、胰岛素、C肽、胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）和胰岛素分泌功能指数（HOMA-β）均与疗程作相关分析。结果单次化疗1d后,血糖、胰岛素和C肽水平均有升高（P〈0.01）,且激素使用组的升高更为明显（P〈0.05）;间隔3～5个疗程后血糖、C肽水平升高也明显（P〈0.01）;胰岛素、HOMA-IR值与既往化疗次数存在正相关关系（P〈0.01）。结论一次化疗即可使患者血糖、胰岛素、C肽水平升高;长期化疗可导致胰岛素升高,并可能引发胰岛素抵抗。     

B7-H4--B7家族的又一新成员

在T细胞活化和耐受的免疫调节中，B7-CD28家族成员介导的T淋巴细胞共刺激信号传导途径起着至关重要的作用。它们不仅在启动、增强和维持T细胞应答中提供了关键的正性信号，而且还可提供重要的负性信号来限制、终止或削弱T细胞的免疫应答。鉴此在病毒感染、肿瘤、移植免疫排斥以及自身免疫性疾病过程中适当地调节或干预这些共刺激信号，将有助于这些疾病的治疗及改善疾病症状。     

肝动脉化疗栓塞联合血管内皮抑制素介入治疗原发性肝癌的疗效和安全性

目的:观察肝动脉化疗栓塞联合血管内皮抑制素介入治疗原发性肝细胞癌的疗效及其安全性.方法:50例原发性肝细胞癌患者接受肝动脉化疗栓塞联合血管内皮抑制素介入治疗.观察治疗后不良反应和近期疗效,以评价治疗的安全性和有效性.结果:50例原发性肝细胞癌患者接受肝动脉化疗栓塞联合血管内皮抑制素介入治疗后,主要不良反应包括Ⅰ～Ⅱ度骨髓抑制以及谷丙转氨酶和谷草转氨酶的升高,未发生严重的治疗相关不良反应.近期疗效显示,50例患者中部分缓解3例,疾病稳定40例,疾病进展7例,疾病控制率为86.0%.结论:肝动脉化疗栓塞联合血管内皮抑制素介入治疗原发性肝细胞癌是安全而有效的.     

转人B7.2基因的L929细胞对T细胞增殖和分泌IL-10的作用

应用RT-PCR法,从由LPS刺激的人的DC细胞中抽提mRNA,扩增获得编码人B7.2分子的cDNA,并将其克隆到PMD18-T载体,经PCR、酶切及测序进行鉴定确证,进而构建PEGZ-term-B7.2的真核表达载体。脂质体法共转染包装细胞293T,用含有完整病毒颗粒的293T细胞的上清感染L929细胞,经Zeocin筛选,建立稳定表达人B7.2分子的L929基因转染细胞株。并证实了B7.2基因转染细胞能有效地促进T细胞的体外增殖和促进IL-10的分泌。