绿色荧光蛋白质粒DNA作为活细胞标记基因的研究

绿色荧光蛋白 (ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ ,ＧＦＰ)来源于可自发荧光的海洋水母 ,其ｃＤＮＡ所编码的蛋白质受到蓝光或紫外光照射时可自发的发出绿色荧光。我们将ＧＦＰ质粒ＤＮＡ转染不同类型的细胞 ,利用ＧＦＰ蛋白标记活细胞。一、方法我们采用的ＧＦＰ真核表达质粒ｐＥＧＦＰ Ｎ1购自Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司 ,ＧＦＰ由人巨细胞病毒即刻早期抗原基因启动子 (ＣＭＶ)所调控。此外 ,ｐＥＧＦＰ Ｎ1还有ｎｅｏ编码基因 ,其表达由猴肉瘤病毒ＳＶ40抗原基因启动子控制。质粒ｐＥＧＦＰ ＩＲＥＳｎｅｏ的骨架ｐＩＲＥＳｎ…     

二氯化钴对腺病毒基因表达的影响

目的:研究二氯化钴(CoCl2)对缺氧反应元件调控E1AE1B表达的条件复制型腺病毒载体(Ad-5HRE-E1AE1B-RFP)和缺乏缺氧反应元件的复制缺陷型腺病毒载体(Ad-EGFP)在肿瘤细胞内表达和复制的影响. 方法:肿瘤细胞经不同浓度的CoCl2 处理后,Western 印迹法检测缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的表达;倒置荧光显微镜、FCM法及空斑形成实验等观察经CoCl2处理后,感染条件复制型腺病毒和(或)复制缺陷型腺病毒的肿瘤细胞中外源基因的表达水平和病毒复制情况;小动物成像仪观察缺氧调控的条件复制型腺病毒在肿瘤内提高复制缺陷型腺病毒表达的效率. 结果:适当浓度的CoCl2 (0.4和0.08 μg/mL) 能使胃癌细胞株(SGC7901)中HIF-1α蛋白稳定表达并积聚,可较好地模拟缺氧状态;在0.4 μg/mL CoCl2作用下,Ad-5HRE-E1AE1B-RFP对肿瘤细胞的感染效率明显提高,表现为外源基因RFP阳性表达的百分率和荧光强度均明显提高,但空斑形成实验显示Ad-5HRE-E1AE1B-RFP并没有复制.0.4 μg/mL CoCl2也能提高其他非缺氧调控的复制缺陷型腺病毒如Ad-EGFP、Ad-Luc的感染效率和表达水平; Ad-5HRE-E1AE1B-RFP与复制缺陷型腺病毒Ad-Luc联合注射裸鼠肿瘤能显著提高Ad-Luc的表达.结论:CoCl2 能明显提高腺病毒的基因表达水平,其作用机制不仅与CoCl2诱导缺氧有关,也可能与影响基因转录有关.     

一种新的高转移膀胱癌动物模型的建立

目的　建立一种简便、可靠的小鼠膀胱癌模型。方法　将绿色荧光蛋白 (GFP)表达质粒导入小鼠膀胱癌细胞株BTT T73 9,G418筛选稳定表达GFP的克隆。然后接种于同系小鼠膀胱壁内及后腿皮下 ,荧光显微镜直接观察肿瘤细胞生长、浸润与微转移 ,流式细胞术定量分析转移的肿瘤细胞数 ,并与常规石蜡切片苏木素 伊红 (HE)染色比较。结果　经GFP标记的肿瘤细胞在荧光显微镜下发出绿色荧光 ,膀胱原位接种 (2～ 4)× 10 5后 1周即出现膀胱肿大、血尿 ,以后膀胱肿大加重、出现输尿管阻塞、肾盂积水 ,以及肾、腹腔、肺、肝、脾等远处转移。结论　GFP标记的BTT T73 9膀胱癌细胞和膀胱癌动物模型可十分简便、准确判断膀胱癌肿瘤细胞生长、浸润与微转移等。     

新型鼠肿瘤皮窗模型

目的建立一种能动态显示活体内肿瘤细胞生长、新生血管形成及靶基因表达水平等的新型动物模型。方法以海洋水母中分离到的绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因,将1×10     

DELETIONS AND POINT MUTATIONS OF p16,p15 GENE IN PRIMARY TUMORS AND TUMOR CELL LINES

Aberrations of chromosome 9 p21-22 are involved in the genesis of many forms of cancer. The gene p16 and p15 kave been assigned to this region. Both p l 6 and p 15 axe an inhibitor of cyclin D-cdk4,cyclin D-odk6 compiex and have been implicated in a wide variety of cancer types,including the germllne of patients with familial melanoma. In order to investigate and compare the status of p16,p15 gene in primary tumors and cell lines,we examined 357 primary tumors and 29 call lines derived from diverse tumor types. In addi-tion to analysis of these primary tumors and cell llnes,blood specimens from 91 patients either with sporadic mulriple cancers or from cancer-prone families were also analyzed. The data showed the foilowing:1)Ho-mozygous deletions of p16,p15 were comparatively rare and far less common than previously reported,al-though hemizygnus deietions were observed in a significant fraction of many tumor types;2)the incidence of p16,p15 deleticms(either homozygous deletions or heterozygous deietions)varied significantly among differ-ent tumor types;3)most delefions involved in both p16 and p15 genes;4)sequence variations in the coding sequence of p16,p15 were comparativeiy rare among these tumor types,though mutations and poiymor-phisrrm were identified; 5)sntne tumors which showed LOll at 9p,contaioing p16 and p15 gene,did not show deletions or point mutations in the p16,p15 gene. 6)In a subset of retinoblastoma and osteosarcoma where no Rb gene mutations were present a significant fraction was found to contain p16,p15 gene dele-tions.     

经绿色荧光蛋白基因修饰的人脉络膜黑色素瘤细胞株OCM-1-gfp的生物学行为与基因表达

目的 研究经绿色荧光蛋白（GFP）基因修饰的人脉络膜黑色素瘤细胞株OCM-1-gfp在小鼠体内的生长过程、转移规律，以及可能影响肿瘤生长和转移的因素。 方法 用脂质体将GFP基因导入人脉络膜黑色素瘤细胞OCM-1，建立稳定、高水平表达GFP的克隆;分别接种到Balb/c裸鼠视网膜下和后大腿皮下，建立原位和异位肿瘤模型。眼内肿瘤生长情况用荧光显微镜直接观察，皮下肿瘤大小用游标卡尺测量;采用免疫组织化学方法对肿瘤内13种基因的表达进行检测。 结果 稳定表达GFP的脉络膜黑色素瘤细胞OCM-1-gfp基本保持了亲代细胞的特征;能在裸鼠体内形成肿瘤并继续生长和转移;在基因表达方面，肿瘤抑制基因p16染色呈阴性，p53染色呈强阳性。其他的肿瘤抑制基因:视网膜母细胞瘤易感基因（Rb）、p21，转录调控因子（E-2F）、核因子κB（NFκB），细胞增生相关基因细胞周期素D1（cyclin D1）、增生细胞核抗原（PCNA），细胞凋亡相关基因bcl-2、bcl-XL/S和bax，以及表皮生长因子（EGF）及其受体（EGFR）呈现不同程度的阳性表达。 结论 GFP为直接观察脉络膜黑色素瘤在体内的生长和转移提供了标记;脉络膜黑色素瘤原位与异位移植瘤模型在成瘤率和生长情况方面无明显差异;由OCM-1-gfp生长形成的肿瘤p16、p53及NFκB、cyclin D1、PCNA及EGF和EGFR等多种基因表达异常。 (中华眼底病杂志, 2006, 22: 170-173)     

p16，p15基因在多种原发恶性肿瘤与肿瘤细胞株中存在状态的研究

由于多种肿瘤细胞株存在ｐ１６、ｐ１５基因的缺失与点突变，而ｐ１６、ｐ１５蛋白本身又能抑制ＣＤＫ４、ＣＤＫ６的活性，阻止细胞增生，为了确定ｐ１６、ｐ１５基因在原发恶性肿瘤发生、发展过程中的作用，应用多重ＰＣＲ、ＳＳＣＰ分析及直接ＤＮＡ序列测定技术检测分析了３５７例原发肿瘤、２９个肿瘤细胞株、９１例散发的多发性肿瘤患者及具有家族性肿瘤高发倾向的肿瘤患者的外周血标本，６１例健康成人外周血标本作为对照。结果表明：原发恶性肿瘤组织中ｐ１６、ｐ１５基因缺失的频率明显低于肿瘤细胞株；ｐ１６、ｐ１５基因缺失的检出率随肿瘤的组织学类型而异；基因缺失的范围较大，通常累及ｐ１６和ｐ１５两个基因；ｐ１６基因编码区的点突变在本组肿瘤中罕见；某些肿瘤如膀胱癌、肾癌尽管存在９ｐ２１－ｐ２２的ＬＯＨ，但却未检出有ｐ１６及ｐ１５基因缺失或点突变。为肿瘤的病因学研究提供了资料。     

病毒与非病毒介导的绿色荧光蛋白基因转导的比较研究

自 1992年绿色荧光蛋白 (ＧＦＰ)基因的ｃＤＮＡ被成功克隆以来 ,由于ＧＦＰ结构稳定、在受到蓝光或紫外光照射时可自发发出绿色荧光 ,而这一过程不需要其他共刺激因子、底物或其他基因产物的协助 ,故在生物医学领域的应用日益广泛[1,2 ] 。因此 ,深入研究各种基因转导方法在ＧＦＰ基因转导方面的效率及优缺点、分析ＧＦＰ对细胞生长速度和生物学行为的影响等 ,对于合理应用ＧＦＰ十分重要。一、材料与方法1 重组质粒 :ＧＦＰ真核表达质粒ｐＥＧＦＰ Ｎ1购自Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司。ＧＦＰ重组逆转录病毒质粒ｐＬＮＣＸ ＥＧＦＰ是我们自己构…     

利用绿色荧光蛋白动态观察活体内肿瘤细胞生长及瘤体形成过程

恶性肿瘤发生的早期少量的肿瘤细胞是怎样生长并形成肿块的 ?当肿瘤形成后肿瘤细胞又是如何浸润周围组织 ,如何在远处建立转移病灶的 ?阐明这些问题对于了解恶性肿瘤发生与转移机制 ,以及设计有效的治疗方案等都是十分必要的。过去由于缺乏理想的活细胞标记 ,在体内众多的正常细胞中显示少量的肿瘤细胞十分困难。在此我们利用绿色荧光蛋白 (ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ ,ＧＦＰ) [1 3 ] 基因标记肿瘤细胞 ,结合皮窗肿瘤动物模型 ,可以非侵入性地、连续并重复地观察移植的肿瘤细胞在动物体内生长及形成瘤体的过程。为今…