中药北豆根抗肿瘤活性的体外实验

背景与目的 :探讨中药北豆根(Rhizomamenispermi)提取物的抗肿瘤作用并分离其活性物质。材料与方法 :采用MTT法测定了北豆根提取物对肿瘤细胞增殖反应的影响 ;用三步法初步分离、纯化了北豆根提取物的抗肿瘤有效部位。结果 :北豆根提取物对多种组织来源的肿瘤细胞增殖有较强的抑制作用 ,量效关系良好 ,并且对原代培养肿瘤组织细胞增殖反应有抑制作用,IC50 多在9μg/ml以下 ,最低可达0.7μg/ml。并找到了其有效部位。结论 :北豆根水提物和北豆根醇提物体外均有很强的抗肿瘤作用 ;醇提物的作用高于水提物 ;PE2是北豆根醇提物抗肿瘤的有效部位 ;PE2不仅对各肿瘤细胞株有广泛的杀伤作用 ,而且对原代培养肿瘤细胞也有杀伤作用 ;北豆根作为抗肿瘤药物有待进一步开发     

微生物来源的次黄嘌呤一磷酸盐脱氢酶抑制剂2264A和B的研究

利用自建的快速高效的次黄嘌呤一磷酸盐脱氢酶(Inosine monophosphate dehydrogenase,IMPDH)抑制剂的高通量筛选模型,筛选分离得到两个活性化合物2264 A和B,通过对其紫外、质谱、核磁等理化数据的分析确定2264 A为cyclopenol,2264 B为viridicatol。2264 A和B对IMPDH的IC50分别为69.68、11.86μmol/L;体外脾淋巴细胞增殖实验显示2264 A和B分别在322.6和65.8μmol/L浓度下可完全抑制由ConA活化的脾淋巴细胞增殖,表明2264 B在分子水平和细胞水平均表现出较好的免疫抑制活性,2264 A的活性相对较弱。     

人单酰基甘油脂肪酶基因的克隆表达、纯化及活性研究

目的人单酰基甘油脂肪酶(human monoacylglycerol lipase,MAGL)是一类促进脂肪分解成甘油和脂肪酸的丝氨酸水解酶,是抗肿瘤药物研发的新靶点。为了建立高通量的MAGL抑制剂筛选模型,本研究对人MAGL进行了基因克隆、体外重组表达、纯化以及活性研究。方法通过RT-PCR方法从人脑总RNA中扩增人MAGL基因,并将该基因克隆入pET28a(+)表达载体。将重组蛋白在E.coli BL21(DE3)宿主菌中通过1mmol/L IPTG诱导表达。表达产物用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱进行分离纯化,通过SDS-PAGE进行分析。以7-hydroxycoumarinyl arachidonate(7-HAC)为荧光底物进行酶的活性测定。结果成功扩增出人MAGL基因,并构建了pET28a-MAGL表达载体。SDS-PAGE检测结果表明重组人MAGL蛋白在宿主菌中的表达量可达菌体总蛋白量的25%,经Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱分离纯化后的重组蛋白纯度大于90%,其比活力达到7900IU/mg,,较纯化前提高了23倍。酶活性分析结果证明重组表达并纯化的蛋白具有单酰基甘油脂肪酶活性,另外,利用已知的MAGL抑制剂N-arachidonylmaleimide(NAM)对该酶表现出强的抑制活性,IC50值为0.53μmol/L。结论本研究成功利用大肠埃希菌原核表达体系重组表达并纯化了人单酰基甘油脂肪酶,为建立以MAGL为靶点的抗肿瘤药物筛选模型奠定了基础。     

微波诱变及添加氯化镧筛选阿扎霉素B高产菌株

目的 拟通过微波诱变和添加氯化镧对阿扎霉素B产生菌N98-1634进行选育,获得高产菌株.方法 对菌株进行40～240s的微波诱变,采用金黄色葡萄球菌抑菌圈法获得初筛通过株,并进行HPLC复筛获得高产菌株;在高产菌株发酵培养基中加入5～30mg/L的氯化镧考查其对阿扎霉素B合成的影响.结果 通过微波诱变选出l株阿扎霉素B产量达到945.0μg/mL的突变菌株MW-638,较出发菌株N98-1634的752.4μg/mL提高了25.6％,随后经过添加15mg/L氯化镧阿扎霉素B单位最终达到1413.8μg/mL.结论 微波诱变对提高菌株N98-1634阿扎霉素B发酵单位效果明显,诱变菌株添加适量氯化镧可以显著提高其产量.     

微生物来源的蛇孢菌素抗肿瘤活性的体外实验研究

背景与目的:探讨微生物来源的3个化合物表蛇孢菌素K、蛇孢菌素K和蛇孢菌素G的体外抗肿瘤作用.材料与方法:利用噻唑蓝(MTT)比色法检测3个化合物对人结肠癌细胞Hct-15、Hct-116,乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7,肺癌细胞A549和白血病细胞K562共6株细胞的体外细胞毒性,并测定其半数抑制浓度值(IC50).利用组织蛋白酶B评价3个化合物对肿瘤浸润和转移的抑制活性.结果:表蛇孢菌素K、蛇孢菌素K和蛇孢菌素G对上述6株细胞均有抑制作用,与阴性对照组相比较,其差异均具有统计学意义(P＜0.05).表蛇孢菌素K对上述6株肿瘤细胞的IC50值依次为:5.70、3.60、28.00、8.40、2.00和3.10 μg/ml.蛇孢菌素K对6株肿瘤细胞的IC50值依次为:1.40、0.81、4.26、3.70、0.91和1.10μg/ml.蛇孢菌素G对6株肿瘤细胞的IC50值依次为:4.1、4.6、26.10、17.10、6.70和6.10 μg/ml.3种蛇孢菌素对组织蛋白酶B的IC50值分别为46、26和23 μg/ml.结论:表蛇孢菌素K,蛇孢菌素K和蛇孢菌素G均具有体外抗肿瘤活性,其中蛇孢菌素K体外活性高于表蛇孢菌素K和蛇孢菌素G.     

不同作用机制的5-脂氧化酶抑制剂筛选方法的建立和应用

目的拟建立体外高通量的用于筛选不同作用机制的5-脂氧化酶（5-lipoxygenase,5-LOX）抑制剂的方法。方法以花生四烯酸为底物,2,7-二氯二氢荧光素乙酰乙酸为荧光反应物,建立荧光测活方法,并通过不加Fe3+和外加10mmol/LFe3+的方法建立两种不同的5-LOX酶反应体系。结果 5-脂氧化酶在不加Fe3+和外加10mmol/LFe³⁺的反应体系中的信号/本底（S/B）值分别为5.02和37.81,两种反应的Z’因子值均约为0.7。5-脂氧化酶铁离子螯合抑制剂齐留通在未加Fe³⁺的反应体系对酶有强的抑制活性,其IC₅₀值为0.21μm,在外加10mmol/L Fe³⁺的反应体系对酶无抑制作用。非铁离子螯合抑制剂去甲二氢愈创木酸在两种反应体系对酶均有抑制作用,其IC₅₀值分别为0.52和0.93μM。利用该方法从微生物代谢产物中筛选到两个活性化合物WF-5239和Trivaric acid,其中化合物WF-5239在未加Fe³⁺的反应体系对酶有强的抑制活性,其IC₅₀值为2μmol/L,在外加10mmol/L Fe³⁺的反应体系对酶无抑制作用,推测可能为铁离子螯合型抑制剂。化合物Trivaric acid在两个筛选体系对酶的抑制作用基本一致,其IC₅₀值均约为5.36μmol/L,推测可能为非铁离子螯合型抑制剂。结论本研究建立了灵敏、稳定的可用于筛选不同作用机制5-LOX抑制剂的方法。     

次黄嘌呤核苷酸脱氢酶抑制剂NO1WB-352A、B的研究

目的 筛选次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)的抑制剂,为新的抗癌药物和免疫抑制剂研发提供先导化合物.方法利用IMPDH抑制剂的高通量筛选方法,筛选放线菌次级代谢产物,发现阳性菌株;对阳性菌株的发酵提取物进行分离纯化获得活性化合物并通过综合波谱解析确定其结构;然后利用多种相关细胞对活性化合物进行活性评价.结果 筛选得到两个活性化合物NO1WB-352A、B;它们对IMPDH的IC50分别为6.01 μmol/L和1.40μmol/L.在细胞毒活性测定中,它们对多种相关细胞的增殖有抑制作用,IC50值如下:对一系列人源癌细胞在11.6～556nmol/L之间;对人脐静脉内皮细胞ECV-304分别为185nmol/L和147nmol/L ;对小鼠T淋巴细胞分别为546nmol/L和425nmol/L.另外,它们对人正常胎肝细胞L02在100 μmol/L浓度下未显示出增殖抑制.结论 N01WB-352A、B为特异性的IMPDH抑制剂,国内外未见报道.在细胞水平上的活性评价显示它们具有一定的开发成抗癌药物和免疫抑制药物的潜力.     

PTP-Shp2抑制剂flavoglaucin的发现与研究

目的 以蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2(PTP-Shp2)为靶点发现其小分子抑制剂。方法 高通量筛选小分子PTP-Shp2抑制剂并进行动力学分析,利用计算机分子对接分析抑制剂在PTP-Shp2上的结合位点。结果 从本实验室微生物代谢产物化合物库中发现了PTP-Shp2蛋白抑制剂flavoglaucin,其IC50值为5.08μmol/L。米氏方程的双倒数分析证明flavoglaucin是非竞争的PTP-Shp2蛋白抑制剂。计算机分子对接结果显示flavoglaucin结合在PTP-Shp2蛋白的WDP loop上并形成3个氢键。结论 Flavoglaucin是微生物来源的新型小分子PTP-Shp2抑制剂。     

新来源棘白霉素B脱酰基酶产生菌的筛选和转化条件优化

目的筛选放线菌来源的棘白霉素B脱酰基酶产生菌,并对其转化条件进行优化。方法根据菌株转化产物对白念珠菌的抑制活性进行初筛,再以HPLC、LC-MS检测确定目的菌株;对目的菌株转化棘白霉素B的培养基、转化温度和时间、缓冲液、甲醇含量等条件进行优化以提高转化率。结果筛选得到4株可产生脱酰基酶的阳性菌株,其中,N07W-.61为小单孢菌属菌株,其余3株为链霉菌属菌株;通过转化条件优化,菌株N07W-61对棘白霉素B的转化率从2.60%提高至61.24%。结论小单孢菌属菌株产生棘白霉素B脱酰基酶为首次报道;该属菌株N07W-61在优化转化条件下对棘白霉素B的转化率有了大幅提高。     

黄酮类化合物F01WB1695B对肝细胞脂肪变性的抑制作用及分子机制研究

 目的:研究黄酮类化合物F01WB1695B对脂肪变性人胚肝细胞L-02中脂质合成的抑制作用及其分子作用机制。 方法: 通过体外油酸诱导L-02细胞发生脂肪化,建立肝细胞脂肪变性细胞模型,再利用不同剂量的F01WB1695B干预脂肪化L-02细胞24 h后,通过油红O染色观察细胞内脂滴量变化,并通过定量检测细胞内甘油三酯(triglyceride,TG)和总胆固醇（total cholesterol,TC）的含量,确定F01WB1695B干预肝细胞脂肪变性的效果。利用报告基因细胞检测方法评价F01WB1695B对代谢性核受体过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome prolife-rator-activated receptors,PPARs)的转录激动作用。利用实时荧光定量PCR方法检测F01WB1695B对脂代谢相关基因硬脂酰辅酶A去饱和酶1 (stearoyl-CoA desaturase 1,SCD1)、酰基辅酶A氧化酶1(acyl-CoA  oxidase 1,ACOX1)和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)mRNA水平的影响。 结果: 与正常组相比,20 mg/L油酸诱导L-02细胞48 h后,油红O染色观察细胞内脂滴量明显增加,模型组TG和TC的含量显著升高, 差异有统计学意义（P＜0.01）;F01WB1695B在20 mg/L浓度及以下时对脂肪化肝细胞无细胞毒作用,F01WB1695B干预脂肪化L-02细胞24 h后,与模型组相比,在0.2~2 mg/L 浓度下细胞内脂滴量明显减少,胞内TG和TC值显著降低（P＜0.05）。瞬时转染的细胞报告基因的转录激活效应研究结果显示,F01WB1695B对核受体PPAR有较高的转录激活效应,其EC50 值为0.5~2.1 mg/L。实时荧光定量PCR结果显示,F01WB1695B可下调脂肪酸合成相关基因SCD1和FASNmRNA的表达,上调脂肪分解代谢相关基因ACOX1mRNA的表达。 结论: 黄酮类化合物F01WB1695B可明显降低脂肪变性肝细胞中TG及TC含量,抑制肝细胞脂肪变性,而该作用机制可能是通过激活 PPAR通路,下调SCD1和FASN mRNA的表达,上调ACOX1mRNA的表达,进而降低细胞内甘油三脂水平。