弓形虫沉默信号调节子2(TgSir2)的克隆表达与多克隆抗体制备

目的 制备特异识别弓形虫沉默信号调节子2(TgSir2)多克隆抗体。方法 以酵母Sir2氨基酸序列为模板,寻找弓形虫基因组中同源序列,并进行信号肽预测。以弓形虫RH株cDNA为模板,构建pET28b-TgSir2重组质粒,转化入大肠埃希菌(E. coli)BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,用镍柱亲和层析法纯化诱导表达产物,并以小鼠抗His标签单克隆抗体作为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)进行鉴定。以纯化的TgSir2蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,获得特异性抗TgSir2多克隆抗体。最后,以此多克隆抗体作为一抗,Western blotting检测与虫体蛋白的反应情况。结果 同源比对找到弓形虫基因组中TgSir2,信号肽分析提示1-15位氨基酸为其信号肽序列。PCR、双酶切及测序结果证实原核表达质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明,IPTG可诱导TgSir2融合蛋白的大量表达。Western blotting结果显示,制备的多克隆抗体既能特异性识别原核表达的TgSir2蛋白,也能识别弓形虫体内的内源性TgSir2蛋白。结论 制备的抗重组TgSir2蛋白多克隆抗体能特异性识别弓形虫RH株的TgSir2蛋白。     

TIP30逆转人非小细胞肺癌吉非替尼耐药的实验研究

  目的  本实验旨在研究TIP30能否逆转非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）的吉非替尼耐药,并探讨其可能的机制。  方法  慢病毒LV-TIP30转染NSCLC吉非替尼耐药株PC9/GR上调TIP30,以PC9/GR、PC9/GR-LVTIP30和PC9/GR-LVNC为研究对象,分别加或不加5 μmol/L吉非替尼处理共6组细胞。CCK8检测细胞增殖抑制率,划痕修复实验、Transwell实验检测细胞迁移侵袭能力,免疫印迹实验检测p-AKT、p-ERK、p-MEK以及核内EGFR蛋白表达水平。  结果  非吉非替尼处理组中,PC9/GR-LVTIP30细胞的增殖、迁移和侵袭能力与PC9/GR细胞相比均受到明显的抑制（P < 0.05）,吉非替尼处理组中PC9/GR-LVTIP30细胞较PC9/GR细胞抑制作用更明显（P < 0.05）;过表达TIP30后,蛋白p-MEK、p-ERK、p-AKT表达水平降低,核内EGFR表达水平较PC9/GR降低,差异均具有统计学意义（P < 0.05）。  结论  上调TIP30能够逆转人非小细胞肺癌PC9/GR细胞对吉非替尼的耐药性,其发挥作用的机制可能是通过抑制EGFR核内化,进而抑制下游信号通路相关蛋白p-AKT、p-ERK、p-MEK激活发挥作用。      

抗弓形虫伴侣蛋白60多克隆抗体制备与鉴定

目的：制备、鉴定抗弓形虫伴侣蛋白60（TgCpn60）特异性多克隆抗体。方法：以弓形虫RH株cDNA为模板，PCR扩增编码TgCpn60的C末端168个氨基酸（TgCpn60C168AA）的507 bp序列片段，构建pGEX-4T-1-TgCpn60C168AA重组质粒。将鉴定正确的质粒转化入大肠埃希菌（E.coli ）BL21，并利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，进而用Glutathione-SepharoseTM4B介质亲和层析法纯化重组蛋白后行SDS-PAGE电泳。以纯化的GST-TgCpn60C168AA蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠，取小鼠血清进行纯化，获得特异性抗TgCpn60C168AA多克隆抗体。以该多克隆抗体为一抗，进行Western blot检测，验证其与虫体蛋白的反应情况。瞬时转染pFNR-RFP质粒至虫体后，采用间接免疫荧光法（IFA）检测TgCpn60与弓形虫顶质体外腔膜标志蛋白NADP+铁氧化还原蛋白还原酶（TgFNR）的共定位情况。结果：经PCR及测序结果证实重组质粒pGEX-4T-1-TgCpn60C168AA构建成功。SDS-PAGE电泳结果表明，GST-TgCpn60C168AA蛋白成功诱导表达。Western blot结果显示，制备的多克隆抗体既能特异性识别GST-TgCpn60C168AA重组蛋白，同时也能识别弓形虫内源性TgCpn60蛋白。IFA结果证实，TgCpn60蛋白与TgFNR蛋白存在共定位现象。结论：制备的抗GST-TgCpn60C168AA重组蛋白多克隆抗体能特异性识别弓形虫内源性TgCpn60蛋白，为进一步研究该蛋白功能提供了有利的工具。