FasL、抗人DR5单克隆抗体诱导肿瘤细胞凋亡的研究

目的：探讨FasL、Anti-DR5 mAb对肿瘤细胞Hela、BGC823、MCF-7、1．342、H9101、D6的杀伤作用及机制。方法：采用RT-PCR、MTY比色法、电泳、DNA倍体分析、Western blot等方法。结果：H9101、Hela细胞株DR5 mRNA水平有表达，D6细胞无表达；H9101、1．342细胞株Fas mRNA水平有表达，D6细胞无表达。H9101、1．342细胞株对FasL、Anti-DR5 mAb敏感并呈剂量依赖性；MCF-7、BGC823细胞株对FasL敏感，对Anti-DR5 mAb相对敏感。Hela对FasL相对敏感，对Anti-DR5 mAb敏感；D6对两种凋亡诱导剂耐受。结论：FasL、Anti-DR5 mAb能不同程度地诱导肿瘤细胞凋亡，其机制与Fas、DR5、Caspase-8、Bcl-2的表达有关。     

人源化抗人肺癌单域抗体基因的构建、表达及活性分析

目的： 构建人源化的抗人肺癌单域抗体hu3D3VH基因, 在大肠杆菌中表达, 对其蛋白活性进行分析.方法： 采用CDR移植技术对mAb3D3的重链可变区进行人源化, 通过重叠PCR获得hu3D3VH的基因.构建pET22（b＋）/hu3D3VH表达载体, 并转化大肠杆菌BL21（DE3）, 在IPTG诱导下表达.表达产物通过Ni亲和层析柱纯化.采用间接ELISA和竞争抑制ELISA法进行活性分析.结果： 通过重叠PCR获得序列正确的目的基因.目的蛋白以包涵体的形式表达, 表达量占菌体总蛋白的30%以上.纯化后, 目的蛋白的纯度达95%以上.hu3D3VH具有与亲本抗体相同的抗原反应性, 并能抑制mAb3D3与L342细胞的结合.结论： 获得的人源化单域抗体hu3D3VH, 保留了与mAb3D3相同的反应性和特异性, 为进一步临床应用奠定了基础.     

诱骗受体DcR3对佐剂型关节炎大鼠模型的作用分析

目的 研究诱骗受体DcR3 对佐剂型关节炎(AA)大鼠模型的作用及其机理.方法 注射弗式完全佐剂建立大鼠佐剂型关节炎(AA)模型,尾静脉注射DcR3蛋白,观察大鼠关节肿胀度、间接 ELISA 检测血清和滑膜液中细胞因子IL-1 β、TNF-α、IFN-γ的变化.RT-PCR检测滑膜和淋巴细胞中DcR3、Fas、FasL mRNA的表达以及脾脏中TGF-β、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10 mRNA的表达.Western blot分析滑膜细胞中Caspase-8、Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2蛋白的表达.结果 DcR3 治疗AA大鼠后,足肿胀度降低;血液和滑膜液的IL-1β、TNF-α、IFN-γ水平下降;脾脏中TGF-β、IFN-γ、TNF-α mRNA 表达下调,IL-4、IL-10 mRNA表达上调;滑膜细胞中Caspase-8、Caspase-3蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调. 结论 DcR3 可以用于实验性大鼠AA的治疗,其治疗机制与调节滑膜细胞FasL、Fas mRNA的表达和血液淋巴细胞中 Fas mRNA的表达,促进滑膜细胞和自身反应性淋巴细胞的凋亡;调节脾脏细胞Th1/Th2细胞因子平衡相关.本研究为进一步阐明RA的发病机理奠定了重要基础,为有效治疗RA提供了新思路.     

抗人DR4、DR5单克隆抗体诱导神经胶质瘤细胞凋亡的实验研究

目的：探讨抗死亡受体DR4、DR5单克隆抗体（mAb）FMU1．4、FMU1．5对3株神经胶质瘤细胞株U343（敏感株）、U138（部分敏感株）、U373（耐受株）的杀伤作用及机制。方法：采用流式细胞术、RT—PCR、免疫细胞化学法、MTT比色法、电泳、DNA倍体分析和Westem blot等方法。结果：DR5在U343高表达；DR4在U373低表达。U343对FMU1．5敏感并呈剂量依赖性、对FMU1．4部分敏感；U138对FMU1．5部分敏感，对FMU1．4耐受；U373对两种抗体耐受。结论：FMU1．4、FMU1．5能不同程度地诱导三株细胞凋亡，其机制与DR4、0115、细胞色素C和FLIP的表达有关。     

TNFAIP8在胃癌组织中表达的研究和临床意义

目的通过检测胃癌组织中肿瘤坏死因子α诱导蛋白8(TNFAIP8)的表达,探讨其与胃癌临床病理参数的关系及与胃癌发生发展的关系,揭示胃癌的发病机制。方法采用免疫组化SP法,检测50例胃癌以及50例正常胃粘膜中TNFAIP8的表达。结果 50例正常胃粘膜组织中TNFAIP8无表达,而在50例胃癌组织中TNFAIP8阳性表达13例,TNFAIP8阳性率为26%。低分化胃癌组TNFAIP8阳性表达率明显高于中分化腺癌组(P<0.05);Ⅲ期胃癌组TNFAIP8阳性表达率明显高于Ⅱ期胃癌组(P<0.05);有淋巴结转移组TNFAIP8阳性表达明显高于无淋巴结转移组;TNFAIP8在不同性别和年龄的胃癌组织中无差异。结论 TNFAIP8的表达与患者的性别和年龄无关,而与胃癌的组织学分级、胃癌的TNM分期和淋巴结转移有相关性。TNFAIP8在胃癌组织中表达率较正常胃粘膜升高,差异有统计学意义(P<0.05),提示TNFAIP8可能参与了胃癌的发生、发展。     

人源化抗人肺癌二价和四价VH单域抗体的制备及活性分析

目的为提高人源化的抗人肺癌单域抗体hu3D3vH的功能性亲和力,制备其二价和四价的抗体分子。方法重组PCR分别将SV5-Cys短肽和p53四聚化结构域基因与hu3D3VH基因融合,而获得同源二聚体dihu3D3VH和同源四聚体tehu3D3VH基因。将两种基因克隆至pET-22b( )表达载体,并分别在E.coli BL21(DE3)中表达。表达产物通过N2 亲和层析柱纯化。用FITC分别标记hu3D3vH、dihu3D3VH和tehu3D3V三种抗体分子,通过免疫荧光实验分析其抗原反应性和特异性,并利用流式细胞术比较分析其功能性亲和力。结果两种基因均以单体形式并主要以包涵体的形式表达,纯化并复性后,其蛋白溶液中分别存在约50%的二聚体和70%的四聚体。dihu3D3VH和te- hu3D3VH均保留了hu3D3VH的抗原反应性和特异性;且与hu3D3VH相比,其功能性亲和力分别提高了约60%和160%。结论采用增加结合价的策略,有效地改善了hu3D3VH的功能性亲和力。     

用于肿瘤血管靶向治疗的RGD/tTF融合蛋白的表达及活性鉴定

目的：制备用于肿瘤血管靶向治疗的重组RGD／tTF融合蛋白，并鉴定其生物学活性。方法：利用PCR技术均建RGD与tTF的融合基因，克隆至表达载体pET22b（＋），在E．coliBL21（DE3）中表达，镍亲和层析柱纯化。凝血实验和FX活化实验鉴定融合蛋白中tTF的活性，间接ELISA分析RGD活性。结果：获得序列正确的RGD／tTF／pET22b（＋）重组子，融合蛋白在E．coliBL21（DE3）中高效表达。纯化后的融合蛋白具有活化FX、引起血液凝固的功能，且能与α，β3特异性结合。结论：成功构建RGD／tTF／pET22b（＋）重组子，RGD／tTF融合蛋白具有TF活性且与d，B，特异性结合，为进一步研究其体内特异性诱发肿瘤组织血管栓塞功能创造了条件。     

抗人DR5单克隆抗体诱导Ｕ343细胞凋亡研究

目的:探讨抗肿瘤坏死因子相关凋亡配体的死亡受体DR5单克隆抗体对神经胶质瘤细胞株U343的杀伤作用及机制.方法:采用流式细胞仪从蛋白质水平定量地检测DR5在U343的表达;用RT-PCR从mRNA水平检测DR5的表达;免疫细胞化学法明确DR5在U343的分布情况.通过MTT法、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪DNA倍体分析,观察抗人DR5单克隆抗体对U343细胞增殖的抑制活性及其诱导凋亡效应.结果:神经胶质瘤细胞株U343表达死亡受体DR5,DR5分布于细胞内细胞核的周围.抗人DR5单克隆抗体3μg/ml作用4 h可明显杀伤U343细胞,其机制与诱导凋亡有关.结论:抗人DR5单克隆抗体可以诱导神经胶质瘤细胞株U343凋亡,以死亡受体为靶点的抗体制剂为肿瘤治疗提供新的途径.     

抗人死亡受体5单链抗体的构建表达纯化及活性分析

目的构建、表达、纯化抗人死亡受体5(DR5)单链抗体,并检测其诱导肿瘤细胞凋亡的活性。方法采用RT-PCR获取鼠源性抗人DR5单克隆抗体重链和轻链可变区基因序列,以一柔性连接肽连接二者,转入表达载体,以大肠杆菌表达融合蛋白,亲和色谱纯化后用MTT实验和凋亡检测试剂盒检测其凋亡诱导活性。结果获得的序列经比对为抗体重链和轻链可变区基因,表达纯化后的重组蛋白具有接近完整抗体的肿瘤细胞凋亡诱导活性。结论抗人DR5 scFv可作为诱导肿瘤细胞凋亡的候选药物,为肿瘤免疫学研究提供材料。     

FasL、抗DR5单克隆抗体对结肠癌细胞株HT29的杀伤作用及其机制

目的 探讨FasL、抗DR5单克隆抗体(Anti-DR5 mAb)对结肠癌细胞株HT29的杀伤作用及机制.方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、噻唑蓝(MTT)比色法、DNA倍体分析,Western blot等.结果 HT29细胞表面Fas mRNA的表达低于DIL5 mRNA的表达.50 mg/L FasL和Anti-DR5 mAb对HT29细胞的杀伤率分别为(25.49±0.90)%和(48.90±3.15)%,这种作用呈剂量依赖性.流式细胞术分析细胞周期和凋亡实验表明FasL和Anti-DR5 mAb能够抑制HT29细胞的生长,并且诱导它的凋亡.25 mg/L FasL和Anti-DR5 mAb对HT29细胞的凋亡指数分别为(13.8±1.5)%和(22.6±1.1)%.FasL和Anti-DR5 mAb作用HT29细胞后,Caspase-3蛋白表达上升,bcl-2蛋白表达水平下降.结论 FasL、Anti-DR5 mAb能不同程度的诱导结肠癌细胞株HT29凋亡,其机制与其受体和Caspase-3、bcl-2的表达有关.