慢病毒介导Ras-GRF1调控肝癌干细胞干性维持与自我更新能力的机制

目的:探究Ras蛋白特异性的鸟苷酸释放因子1（Ras protein specific guanylate releasing factor 1,Ras-GRF1）在肝癌干细胞（cancer stem cells,CSC）生物学特性及自我更新中的作用,并初步探究其作用机制。方法:实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测人正常肝细胞系（HL-7702）和不同肝癌细胞系（Huh7、HepG2、Hep3B、CLC4、CLCl3、SMMC-7721）中Ras-GRF1表达水平;流式细胞术分选出肝癌干细胞,利用Ras-GRF1-pCMV6-GFP重组慢病毒感染肝癌干细胞,MTT法、EdU染色和平板克隆形成实验检测过表达Ras-GRF1对肝癌干细胞增殖能力的影响;Transwell小室实验检测过表达Ras-GRF1后肝癌干细胞迁移与侵袭变化;成球实验检测过表达Ras-GRF1后肝癌干细胞的自我更新能力;蛋白免疫印迹（Western blot）检测肿瘤干细胞中Hippo信号通路关键蛋白大肿瘤抑制因子（large tumor suppressor,LATS）、Yes协同蛋白（Yes cooperative protein,YAP）和哺乳动物STE20样蛋白激酶（mammalian STE20-like protein kinase,MST）的蛋白及磷酸化表达水平。结果:不同肝癌细胞中Ras-GRF1 mRNA表达量较人正常肝细胞中显著降低（P＜0.05）;分离到的肝癌干细胞在感染Ras-GRF1-pCMV6-GFP重组慢病毒后,细胞中Ras-GRF1 mRNA表达量显著升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）;在两种肝癌干细胞 HepG2-CSC和SMMC-7721-CSC中,相较于空白对照组,Ras-GRF1-pCMV6组细胞增殖活性显著降低,EdU阳性染色数目和细胞克隆形成数目均显著减少,细胞迁移与侵袭数目也均显著减少,细胞成球能力明显降低,p-LATS/LATS、p-YAP/YAP及p-MST/MST蛋白表达显著增加,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。结论:通过慢病毒介导Ras-GRF1在肝癌干细胞中过表达后,能够抑制肝癌干细胞的增殖、迁移与侵袭,降低自我更新能力,其机制可能与调控Hippo信号通路相关。     

肝癌SMMC-7721细胞中侧群细胞分选及其生物学特性的研究

目的: 分选肝癌SMMC-7721细胞中的侧群(SP)细胞并分析其生物学特性。方法: 采用流式细胞荧光激活分选(FACS)技术将SMMC-7721细胞分为SP细胞和非侧群(NSP)细胞2个亚群。细胞生长曲线法和平板克隆法比较SP细胞和NSP细胞的增殖能力和克隆形成能力;Transwell法检测SP细胞和NSP细胞的迁移及侵袭能力;流式细胞术分析细胞周期及细胞凋亡率;裸鼠体内成瘤实验比较SP细胞和NSP细胞的致瘤性。结果: SMMC-7721细胞中分选出的SP细胞比例为(9.2±0.2)%。SP细胞中G₀/G₁期细胞比例高于NSP细胞,凋亡率低于NSP细胞(P＜0.05);SP细胞的增殖速度、克隆形成能力、体外迁移和侵袭能力均明显高于NSP细胞(P＜0.05);裸鼠成瘤实验显示SP细胞的致瘤能力明显高于NSP细胞。结论: 肝癌SMMC-7721细胞中的SP细胞可能富集了肝癌干细胞。     

肝癌SMMC-7721细胞中侧群细胞干细胞标记的表达

目的 分选肝癌细胞株SMMC-7721中的侧群(SP)细胞,并分析其干细胞标记的表达.方法 采用流式细胞荧光激活分选(FACS)技术将SMMC-7721细胞分为SP细胞和非侧群(NSP)细胞两个亚群,以实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)技术和流式细胞术对两个亚群细胞干细胞标记mRNA和蛋白表达进行分析.结果 SMMC-7721细胞株中分选出的SP细胞比例为(9.2±0.2)%.SP细胞ABCG2、CD133、Oct4、Sox2和NANOG等干细胞标记mRNA的表达水平分别是NSP细胞的7.132倍、4.985倍、8.642倍、5.095倍和5.164倍,差异均有统计学意义(P＜0.01);ABCG2、CD133、Oct4、Sox2和NANOG蛋白在肝癌SP细胞中的含量分别为(92.65±3.92)%、(12.75±1.62)%、(17.35±2.31)%、(9.57±1.71)%和(28.39±5.28)%,在NSP细胞中的含量分别为(0.26±0.06)%、(2.51±0.17)%、(1.74±0.38)%、(1.52±0.41)%和(3.37±1.02)%,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 肝癌SMMC-7721细胞中的SP细胞可能富集了肝癌干细胞,联合应用多种干细胞标记筛选肝癌SP细胞可能会获得纯化的肝癌干细胞.

Abstract：

Objective To study the expression of stem cell markers in side population cells sorted from SMMC-7721 cell line. Methods Fluorescence-activated cell sorting (FACS) was used to sort side population (SP) cells and non-SP (NSP) cells from SMMC-7721 cell line. Real-time polymerase chain reaction (PCR) and flow cytometry (FCM) were used to evaluate the expression of several stem cell markers such as ABCG2, CD133, Oct4, Sox2 and NANOG in SP cells and NSP cells. Results FACS analysis indicated that (9.2 ±0. 2)% of the SMMC-7721 cells were SP cells. Real-time PCR analysis suggested that ABCG2, CD133, Oct4, Sox2 and NANOG were expressed in the SP cells at higher levels than the NSP cells by about 7. 132, 4. 985, 8. 642, 5.095 and 5. 164 folds, respectively ( P ＜0. 01 ). FCM analysis revealed that the expression of ABCG2, CD133, Oct4, Sox2 and NANOG proteins in SP cells was (92. 65 ±3.92)%, (12.75 ±1.62)%, (17.35 ±2.31)%, (9.57 ± 1.71)% and (28.39 ±5.28)% respectively,while in NSP cells that was (0. 26 ±0. 06)%, (2. 51 ±0. 17)%, ( 1.74 ±0. 38)%, ( 1.52 ±0. 41 )% and ( 3.37 ± 1.02) % respectively ( P ＜ 0. 01 ). Conclusion The SP cells sorted from SMMC-7721 cell line may enrich tumor stem cells. Purified liver cancer stem cells may be obtained by screening SP cells using a variety of stem cell markers.     

骨形态发生蛋白-2调控MAPK信号通路在肝癌干细胞特征维持中的机制研究

目的:探究骨形态发生蛋白-2(BMP-2)在肝癌干细胞特征维持中的作用及其相关机制。方法:采用qRT-PCR检测肝癌患者癌组织及其癌旁组织BMP-2和CD133的表达水平。通过慢病毒将PLK-NC和PLK-BMP-2转染至HepG2细胞,设空白对照组(未转染)、PLK-NC组(转染PLK-NC)、PLK-BMP-2组(转染PLK-BMP-2)与PLK-BMP-2+PNU-120596组(转染PLK-BMP-2后给予5μmol/L PNU-120596孵育24 h)。采用qRT-PCR检测各组细胞BMP-2、EpCAM、CD133、CD24基因表达水平,Western blot检测BMP-2、p-MAPK蛋白表达水平。通过有限稀释法测定各组干细胞的成球频率差异。结果:与癌旁组织比较,癌组织BMP-2和CD133表达水平升高。与PLK-NC组比较,PLK-BMP-2组BMP-2、EpCAM、CD133、CD24基因表达水平升高,BMP-2、p-MAPK蛋白表达水平升高,细胞成球频率增加(均P<0.05)。与PLK-BMP-2组比较,PLK-BMP-2+PNU-120596组BMP-2...     

miR-144对胰腺癌SW1990细胞增殖、迁移、侵袭及PI3K通路的影响

探讨miR-144对胰腺癌SW1990细胞增殖、迁移、侵袭及磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）通路的影响。方法 采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测人正常胰腺上皮细胞系HPDE与胰腺癌SW1990细胞中miR-144表达水平。将miR-144阴性对照质粒、miR-144 mimic质粒分别转染至SW1990细胞,分别命名为阴性转染组、miR-144过表达组,未经处理的细胞命名为空白对照组。采用RT-qPCR法检测各组miR-144表达水平;CCK-8法检测细胞增殖情况;平板细胞克隆形成实验检测菌落形成;Transwell检测细胞迁移及侵袭能力;Western blot法检测PI3K通路中PI3K及其磷酸化蛋白（p-PI3K）、丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（Akt）及其磷酸化蛋白（p-Akt）的表达水平。结果 SW1990细胞中miR-144的表达水平显著低于HPDE细胞（P<0.05）;miR-144过表达组中miR-144表达水平显著高于空白对照组和阴性转染组（P<0.05）、细胞增殖率、菌落形成、迁移及侵袭数量和p-PI3K、p-Akt蛋白表达水平均显著低于空白对照组、阴性转染组（均P<0.05）。结论 miR-144在胰腺癌细胞SW1990中呈低表达,上调miR-144表达水平有效抑制胰腺癌细胞增殖、迁移及侵袭,其机制可能与PI3K通路抑制有关。     

肝细胞癌组织中三磷酸腺苷结合盒转运体G2和CD133蛋白的表达

目的:检测人肝细胞癌(HCC)组织中干细胞标志物三磷酸腺苷结合盒转运体G2(ABCG2)和CD133蛋白的表达.方法:采用免疫组织化学法检测48例HCC及癌旁正常肝组织中ABCG2和CD133蛋白的表达,并分析其表达情况与临床病理特征的关系.结果:ABCG2蛋白阳性表达率在HCC和癌旁肝组织中分别为47.9%(23/4...     

原发性肝癌切除术后高胆红素血症临床分析

目的 探讨原发性肝癌切除术后胆红素变化的规律及导致高胆红素血症的临床因素.方法 回顾性分析97例原发性肝癌切除术患者临床资料,根据术后血清总胆红素水平分为高胆红素组和胆红素正常组,观察术后胆红素变化特点,分析导致术后高胆红素血症的临床因素.结果 红素正常组术后血清总胆红素4 d达峰值[(21.5±9.2)μmol/L],术后14 d可降至正常水平;高胆红素血症组血清总胆红素7 d达峰值[(49.2±25.4)μmol/L],术后14 d仍高于正常值2倍[(36.1 ±17.6)μmol/L].单因素Logistic分析显示:术前胆红素水平,肝功能Child分级,术中肝血流阻断方式,出血量,输血情况以及术后合并低钠血症与术后高胆红素血症有关;多因素Logistic回归分析结果 表明术前胆红素水平是原发性肝癌切除术后高胆红素血症独立预测指标(OR=5.406,χ2=11.319,P=0.001).结论 原发性肝癌切除术后动态监测血清胆红素水平是重要的.围手术期对发生商胆红素血症的相关临床因素积极防范并处理,可降低肝癌切除术后并发症发生率.