RIG-Ⅰ基因剔除小鼠表型的初步分析

目的 的通过对视黄酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ基因)剔除小鼠表型的分析,在整体动物水平揭示RIG-Ⅰ的生物学功能.方法 Northern blotting和半定量RT-PCR检测小鼠组织中RIG-Ⅰ基因的表达;对小鼠的表型分析包括体质量的测量、外周血细胞分类计数、代谢指标测定及病理组织学检查.结果 RIG-Ⅰ在小鼠多种组织中广泛表达,但表达水平存在一定差异.RIG-Ⅰ基因剔除后,小鼠未见明显发育异常;无明显预期的粒系分化受阻表现;但RIG-Ⅰ基因剔除小鼠外周血相中的粒/淋比明显倒置,且对条件性致病菌易感.结论 RIG-Ⅰ在小鼠抗细菌免疫过程中具有重要作用.     

维甲酸诱导基因I对氧固醇7α羟化酶的调控作用研究

【立论依据】 基因芯片结果显示,敲除维甲酸诱导基因I(RIG-I)的小鼠体内氧固醇7α羟化酶(下文称CYP7B1)基因水平发生变化,说明两者存在慢反应联系,本实验目的旨在探究这两个基因之间是否存在直接调控的快反应联系。 【设计思路】 本实验首先需要对基因芯片的结果进行确定,随后通过多种方式改变RIG-I的表达水平(干扰素刺激、质粒转染等),观察CYP7B1是否存在明显的协同表达变化。如果能确定两者之间确实存在直接调控关系,将进一步探究调控的具体机制,从分子水平阐释调控的环节。 【实验内容】 利用real-time PCR检测基因芯片结果;利用IFNγ上调RIG-I表达水平,并运用real-time PCR检测CYP7B1的表达水平变化;构建载有RIG-I基因的质粒并进行质粒转染,运用real-time PCR和蛋白质印迹法检测CYP7B1的基因表达和蛋白表达变化情况;转染RIG-I promoter,探究其调控CYP7B1的具体机制。 【材料】 细胞:293T细胞、Hela细胞、HepG2细胞等;其他:RIG-I、CYP7B1引物、一抗、二抗及其他常规所需试剂。 【可行性】 预实验中已经确定了RIG-I与CYP7B1间存在慢反应调控关系,同时也确定了相关文献中IFN-γ对RIG-I的上调作用,实验器材、试剂齐备。 【创新性】 本实验首次提出RIG-I基因与CYP7B1及其所参与的脂代谢过程有调控关系,对胆固醇代谢、神经甾体代谢、及CYP7B1缺乏所引起的一系列疾病的研究也可以提供一定的实验依据和理论支持。     

RIG-Ⅰ与干扰素信号通路的关系

目的 研究干扰素(IFNs)对维甲酸诱导Ⅰ型基因(RIG-Ⅰ)的调控作用,同时探讨RIG-Ⅰ对IFNs生物学效应的介导作用.方法 Northern杂交和半定量RT-PCR检测小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)、在IFNs作用前后RIG-Ⅰ基因的表达.MTT比色法和细胞病变抑制法比较野生型和RIG-基因剔除(RIG-Ⅰ-/-)小鼠的MEFs在IFNs作用前后的生长情况和抗病毒活性.结果 IFN-γ、IFN-β均能上调小鼠MEFs中RIG-Ⅰ的表达;100 U/mL IFN-γ处理后,野生型小鼠MEFs的生长抑制较RIG-Ⅰ-/-小鼠的MEFs明显;RIG-Ⅰ缺失后,IFN-β对细胞病毒感染的保护作用较野生型明显减弱.结论 RIG-Ⅰ是一新发现的介导干扰素细胞效应的基因,它可能通过调节细胞因子的产生参与干扰素介导的炎症反应.     

RIG-Ⅰ与干扰素信号通路的关系

目的研究干扰素(IFNs)对维甲酸诱导Ⅰ型基因(RIG-Ⅰ)的调控作用,同时探讨RIG-Ⅰ对IFNs生物学效应的介导作用。方法Northern杂交和半定量RT-PCR检测小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)、在IFNs作用前后RIG-Ⅰ基因的表达。MTT比色法和细胞病变抑制法比较野生型和RIG-基因剔除(RIG-Ⅰ-/-)小鼠的MEFs在IFNs作用前后的生长情况和抗病毒活性。结果IFN-γ、IFN-β均能上调小鼠MEFs中RIG-Ⅰ的表达;100 U/mL IFN-γ处理后,野生型小鼠MEFs的生长抑制较RIG-Ⅰ-/-小鼠的MEFs明显;RIG-Ⅰ缺失后,IFN-β对细胞病毒感染的保护作用较野生型明显减弱。结论RIG-Ⅰ是一新发现的介导干扰素细胞效应的基因,它可能通过调节细胞因子的产生参与干扰素介导的炎症反应。     

AML1-MTG16融合基因的构建及其致瘤性的研究

目的　研究用重叠延伸剪接术 (splicing overlaping extension,SOE)方法获取少见融合基因的转录本。了解 AML1- MTG16融合基因的致瘤性。方法　通过 SOE重组 ,将 AML1、MTG16基因的两个片段经 PCR融合起来 ,形成 AML 1- MTG16融合基因的编码部分。将 MTG16 ,AML 1- MTG16融合基因及切除 AML1- MTG16融合基因 、 两个功能域 (motif)的基因片段 (AML1- MTG16 - S )分别插入p EGFP- C1,p Ds Red- N1载体中 ,利用脂质体转染 NIH3T3细胞 ,4 8小时后激光共聚焦显微镜观察。后G4 185 0 0 μg/ ml筛选 1月 ,获稳定转染细胞后绘制生长曲线 ;做软琼脂克隆形成实验及裸鼠致瘤实验。结果　测序结果表明 ,利用 SOE重组获得的 DNA片段含有 AML 1- MTG16融合基因完整的 CDS部分。比较p EGFP- C1、p EGFP- C1- AML1- MTG16质粒稳定转染的 NIH3T3细胞的生长曲线 ,后者增殖明显。软琼脂克隆形成试验显示 ,转染了 p EGFP- C1的 NIH3T3细胞在 6孔板内未形成克隆 ;转染了 p EGFP- C1-AML1- MTG16的 NIH3T3细胞在 6孔板内每孔平均形成 (47.7± 2 .7)个克隆 ,且使裸鼠致瘤。通过激光共聚焦显微镜观察 ,融合有 MTG16、AML 1- MTG16、AML 1- MTG16 - S 基因片段的绿荧光蛋白或红荧光蛋白在胞核表达 ,MTG16与 AML1- MTG16、AML1-     

NUP98-PMX1转基因小鼠发生髓系白血病样表型

目的　在整体动物水平研究NUP98 PMX1融合蛋白的致白血病作用。方法　采用分子克隆技术构建含有NUP98 PMX1的转基因质粒 ,显微注射法建立转NUP98 PMX1基因的小鼠 ,以PCR、RT PCR方法检测融合基因的表达 ;用流式细胞仪检测骨髓细胞表型。结果　转染NUP98 PMX1融合基因的NIH3T3细胞生长加快 ,软琼脂上可形成集落 ,并使裸鼠致瘤。出现病态的 8只NUP98 PMX1转基因小鼠中有 4只发生粒细胞白血病样表型 ,其中 3只表现为人类慢性髓系白血病样表型。结论　NUP98 PMX1融合基因具有致瘤性 ,其表达在髓系白血病的发生中起着极为重要的作用。     

RIG-Ⅰ基因剔除小鼠表型的初步分析

目的 的通过对视黄酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ基因)剔除小鼠表型的分析,在整体动物水平揭示RIG-Ⅰ的生物学功能.方法 Northern blotting和半定量RT-PCR检测小鼠组织中RIG-Ⅰ基因的表达;对小鼠的表型分析包括体质量的测量、外周血细胞分类计数、代谢指标测定及病理组织学检查.结果 RIG-Ⅰ在小鼠多种组织中广泛表达,但表达水平存在一定差异.RIG-Ⅰ基因剔除后,小鼠未见明显发育异常;无明显预期的粒系分化受阻表现;但RIG-Ⅰ基因剔除小鼠外周血相中的粒/淋比明显倒置,且对条件性致病菌易感.结论 RIG-Ⅰ在小鼠抗细菌免疫过程中具有重要作用.     

活性氧影响SKOV3细胞间充质转化及其机制研究

目的:探讨活性氧(ROS)对卵巢上皮性癌细胞株SKOV3细胞的间充质转化的影响及其中可能存在的分子机制。方法:1通过采用ROS生成剂大黄素(Emodin)、ROS清除剂二硫苏糖醇(DTT)调节卵巢上皮性癌细胞株SKOV3细胞内ROS水平,采用PCR技术及蛋白印迹法测定3组(Emodin组、DTT组、对照组)细胞中间充质转化标志分子E钙黏蛋白(E-cadherin)mRNA及蛋白的表达,比较细胞株侵袭转移能力。2结合改变活性氧水平,构建缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的化学合成,小干扰RNA(SiRNA)沉默HIF-1α表达(HIF-1αSiRNA组、DTT组、对照组),比较HIF-1αmRNA的表达。3使用赖氨酰氧化酶(LOX)抑制剂β-氨基丙腈(β-APN)抑制LOX表达,观察各组(Emodin组、DTT组、β-APN组、Emodin+β-APN组、对照组)细胞HIF-1α、LOX、E-cadherin mRNA及蛋白表达。结果:1SKOV3细胞Emodin组ROS水平较对照组明显升高[(164.85±8.93)%vs(97.42±6.47)%,P0.01],E-cadherin mRNA及蛋白的表达均较对照组显著降低(P0.05),Emodin组的细胞侵袭率高于对照组[(19.48±0.49)%vs(10.74±2.38)%,P0.01],而DTT组结果与之相反,与对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。2HIF-1αSiRNA作用下,HIF-1αSiRNA组的HIF-1αmRNA表达较对照组降低(0.20±0.09 vs 0.87±0.10,P0.05),LOX mRNA表达较对照组降低(0.40±0.08 vs 3.76±0.66,P0.05),而E-cadherin mRNA表达较对照组增高(1.01±0.15 vs 0.30±0.09,P0.05)。DTT组的效果较HIF-1αSiRNA组更为显著,两组比较,差异均有统计学意义(P0.05)。3β-APN作用下,β-APN组的HIF-1α蛋白表达较对照组无明显变化(0.92±0.19 vs 0.94±0.09,P0.05),LOX蛋白表达较对照组降低(0.35±0.11 vs 0.81±0.13,P0.05),而E-cadherin蛋白表达较对照组增高(4.65±0.90 vs 2.23±0.61,P0.05)。结论:使ROS升高,上调HIF-1α,使LOX过表达,进而下调E-cadherin,ROS可能介导卵巢癌细胞间充质转化,继而发生侵袭转移。     

大黄素提高胰腺癌细胞化疗敏感性的机制研究

目的 探讨大黄素能否提高胰腺癌细胞化疗敏感性及其作用机制.方法 设立对照组(正常人皮肤成纤维细胞/胰腺癌BXPC-3细胞),顺铂组(5 mg/L),吉西他滨组(0.5 μmol/L),大黄素与顺铂联合组(50 μmol/L、5 mg/L),大黄素与吉西他滨联合组(50 μmol/L、0.5 μmol/L).应用MTT法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,RT-PCR法检测不同细胞株中多药耐药相关蛋白1(MRP1)、多药耐药相关蛋白2(MRP2)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)和P-糖蛋白(P-gp)mRNA的表达.采用t检验比较两组差异.结果 顺铂组胰腺癌BXPC-3细胞的存活率和凋亡率分别为62.44%±3.42%和27.10%±4.24%,大黄素与顺铂联合组胰腺癌BXPC-3细胞的存活率和凋亡率分别为30.53%±0.05%和66.33%±9.37%,两组比较,差异有统计学意义(t=13.20,5.35,P<0.05).吉西他滨组胰腺癌BXPC-3细胞的存活率和凋亡率分别为79.82%±2.83%和13.48%±1.65%,大黄素与吉西他滨联合组胰腺癌BXPC-3细胞的存活率和凋亡率分别为45.65%±2.46%和62.74%±10.18%,两组比较,差异有统计学意义(t=12.89,8.28,P<0.05).顺铂组和大黄素与顺铂联合组正常人皮肤成纤维细胞存活率比较,差异无统计学意义(t=2.08,P>0.05).吉西他滨组和大黄素与吉西他滨联合组正常人皮肤成纤维细胞存活率比较,差异无统计学意义(t=0.64,P>0.05).在胰腺癌BXPC-3细胞中,只能检测到MRP1 mRNA的表达,未能检测到MRP2、BCRP、P-gp mRNA的表达.顺铂组胰腺癌BXPC-3细胞的MRP1 mRNA表达水平显著降低,而大黄素与顺铂联合组胰腺癌BXPC-3细胞的MRP1 mRNA表达水平则进一步下调.结论 大黄素能够提高胰腺癌细胞对顺铂的敏感性,其机制与下调的MRP1 mRNA表达有关.