层粘连蛋白及其受体在卵巢癌组织中的表达及其临床意义

肿瘤转移扩散是卵巢癌患者死亡最常见的原因。层粘连蛋白(LN)作为细胞外基质和基底膜的重要组织成分，与肿瘤细胞表面的层粘连蛋白受体(LNR)结合，在肿瘤浸润、转移中发挥重要作用。本研究采用免疫组织化学(组化)EnVision二步法检测了正常卵巢、良性卵巢肿瘤和卵巢癌组织中LN及其相对分子质量为67000的受体(67LNR)的表达，探讨其与卵巢癌病理分化程度、临床分期、腹水形成和转移的关系。     

反义LRP寡核苷酸对卵巢癌多药耐药细胞系OVCAR-3顺铂耐药性的影响

目的:探讨针对肺耐药基因(LRP gene)设计的反义寡核苷酸(AsODN)对人卵巢癌多药耐药细胞系OVCAR-3顺铂(DDP)耐药性的逆转作用.方法:采用罗丹明B(SRB)显色法检测LRP AsODN和DDP细胞毒性作用;采用脂质体(1iplfectamine 2000)介导LRP AsODN转染人卵巢癌多药耐药细胞系OVCAR-3;采用逆转录酶链式反应(RT-PCR)和Westem blot法检测LRP AsODN转染前后OVCAR-3细胞中LRP的表达:采用流式细胞仪测定OVCAR-3细胞在顺铂作用后的凋亡率.结果:LRP AsODN浓度低于800nmol/L时,对OVCAR-3细胞无明显细胞毒作用;LRP AsODN能明显减少OVCAR-3细胞中LRP mRNA和蛋白的表达,增加其顺铂敏感性,且与剂量呈正相关;转染LRP AsODN前后的OVCAR-3细胞在DDP作用后,凋亡率分别为(15.43±1.14)%和(27.43±2.05)%,两者间差异有显著性意义(p=0.001).结论:LRP AsODN能有效阻断OVCAR-3细胞内LRP的表达,恢复细胞对DDP的敏感性.     

HDAC抑制剂丁酸钠抑制芳香酶肿瘤相关性启动子活性的研究

目的：探索芳香酶基因乳腺癌相关启动子特异性阻滞剂定点抑制肿瘤局部组织原位雌激素合成的可能性。方法：从乳腺癌标本中获取原代脂肪成纤维细胞进行培养，加入乳腺癌细胞MCF-7的条件培养液，作为芳香酶肿瘤相关性启动子(PI1，PI3)激活的研究细胞模型。用启动子特异性逆转录PCR、芳香酶活性检测等方法观察抗组蛋白乙酰化酶(HDAC)抑制剂丁酸钠(NaBu)对PI1，PI3活性的影响。结果：NaBu特异性抑制PI1，PI3基础和诱导水平转录本，但对另一种芳香酶启动子P14的表达无明显影响。其机制在于抑制PI1，PI的转录。结论：NaBu在乳腺癌治疗中具有潜在的临床价值，进一步研究丁酸钠的分子效应靶点，将为了解乳腺癌发病的关键环节提供良好的切入点。     

短发夹状RNA抑制AKT2基因表达增强卵巢上皮性癌细胞对紫杉醇敏感性的研究

RNA干扰（RNAi）技术是运用双链RNA引发的转录后水平基因沉默机制,特异性抑制靶基因转录,进而下调相应蛋白表达水平及功能.新近的RNAi技术,是利用DNA载体直接在体内表达短发夹状RNA（shRNA）,特异性封闭相应的靶基因mRNA,抑制mRNA的翻译.与早期的RNA干扰技术相比,该方法的特异性和干扰效率均有较大提高,已广泛应用于多种研究领域.利用RANi技术特异地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达,使这些基因保持在沉默或休眠状态,从而使肿瘤细胞增殖速度减慢,凋亡加快,显示了RNAi技术用于肿瘤基因治疗的可行性和有效性.     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂Apicidine对宫颈癌HeLa细胞的抑制作用及机制研究

目的:探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂Apicidine对宫颈癌细胞的杀伤作用和机制。方法:用不同浓度的Apicidine作用于体外培养的宫颈癌细胞株HeLa和正常呼吸道上皮细胞REC;用MTT法检测细胞生长存活率;用流式细胞术(FCM)定量检测细胞凋亡及细胞周期的变化;用RT-PCR法和Western blot法分析Apicidine作用后宫颈癌细胞中p21WAF1和p53表达的变化。结果:Apicidine纳摩尔级浓度即能有效地抑制宫颈癌细胞增殖,对正常细胞无明显抑制效应。FCM结果表明,Apicidine能显著诱导宫颈癌细胞发生凋亡,对正常细胞无明显促凋亡作用;加入2μmol/L Apicidine作用24h和48h后宫颈癌细胞HeLa凋亡率分别为(10.11±0.63)%和(23.28±0.34)%,差异有显著性(P<0.05),正常呼吸道上皮细胞REC凋亡率分别为(5.81±0.92)%和(6.8±0.55)%,差异无显著性(P>0.05);FCM结果亦表明,Apicidine主要引起G0/G1期细胞周期阻滞,1μmol/L Apicidine处理24h后HeLa细胞G0/G1期细胞显著增多,由(46.8±3.2)%增至(69.5±6.1)%,差异有统计学意义(P<0.05);RT-PCR和Western blot结果显示,Apici-dine能显著诱导p21WAF1RNA和蛋白水平表达,对p53表达无明显影响。上述结果都呈现明显的量-效与时-效关系。结论:Apicidine在体外能有效地抑制人宫颈癌细胞生长,对人正常细胞无明显影响,其抗肿瘤生长机制之一可能是通过上调p21WAF1蛋白水平和引起G0/G1期细胞周期阻滞实现的。     

短发卡状RNA抑制AKT2基因表达增强卵巢癌细胞对紫杉醇敏感性的研究

目的：构建AKT2基因特异性短发卡状RNA（shRNA）真核表达载体,观察RNA干扰（RNAi）技术,对人卵巢癌A2780和SKOV3细胞中AKT2蛋白激酶表达的抑制作用,并探讨其促进细胞凋亡的机制。方法：运用基因工程技术,设计合成针对AKT2mRNA的特异性shRNA,构建真核表达载体pAKT2-shRNA。将pAKT2-shRNA经脂质体（Lipofectamine^TM 2000）包裹转染人卵巢癌A2780和SKOV3细胞,荧光显微镜观察细胞内DsRed红色荧光蛋白的表达,计算转染效率,半定量RT—PCR（Semi-quantitative RT-PCR）、蛋白质免疫印迹（Western blot）检测AKT2的表达及干扰效率,流式细胞学检测法（FACS）检测细胞凋亡率,比较抑制AKT2基因前后卵巢癌细胞抵抗凋亡能力。结果：成功构建了PAKT2-ShRNA载体。A2780和SKOV3细胞转染pAKT2-shRNA后,荧光显微镜下观察转染效率约40％;Semi-quantitative RT-PCR和Western blot检测结果示,转染后AKT2 mRNA和蛋白表达均显著降低。FACS检测结果显示,转染pAKT2-shRNA后,紫杉醇25nmol／L处理细胞12h,与空白对照组和阴性对照组相比,细胞凋亡率显著增加,P〈0．05。结论：构建的pAKT2-shRNA真核表达载体能有效抑制AKT2基因表达;运用RNAi技术,降低卵巢癌细胞中AKT2基因表达水平,能增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,促进肿瘤细胞凋亡。     

RhoC/ROCK-Ⅰ信号通路的过度激活对卵巢癌细胞恶性行为的影响

目的 探讨 RhoC/ROCK-Ⅰ的过度激活对卵巢癌细胞生物学特性的影响.方法 RT-PCR 及 Western blot检测 RhoC 及ROCK-Ⅰ在卵巢癌细胞 SW626、Skov-3、A2780 和 Caov-3 中 mRNA 及蛋白的表达水平;将携带ROCK-Ⅰ组成性激活突变体 p160ROCK-Ⅰ△3的质粒(pCAG-myc-p160ROCK-Ⅰ△3)以脂质体介导,转染上述 4 株人卵巢癌细胞,划痕试验和 Boyden 小室检测转染前后 4 种卵巢癌细胞的体外迁移与侵袭能力的变化,MTT 比色法测定 p160ROCK-Ⅰ△3 对细胞增殖能力的影响.结果 RhoC 和 ROCK-Ⅰ在 4 种卵巢癌细胞中呈不同程度表达,其中 RhoC 的表达水平与癌细胞侵袭力和迁移能力呈正相关(r=0.95,P<0.01),转染 pCAG-myc-p160ROCK-Ⅰ△3后,4 株细胞的侵袭能力与对照组比较分别提高31.1%、33.0%、24.5%和39.4%;迁移能力分别提高33.9%、33.0%、25.0%和40.2%.各株细胞的增殖能力未显示出明显的变化.结论 RhoC/ROCK-Ⅰ信号通路的活性与卵巢癌细胞的体外侵袭和迁移能力相关,ROCK-Ⅰ活性的提高可显著增强卵巢癌肿瘤细胞的体外侵袭和迁移能力.     

人Bub1基因shRNA真核表达质粒的构建及其对人卵巢癌细胞SKOV3紫杉醇敏感性的影响

目的 构建人Bub1 shRNA真核表达质粒,鉴定该质粒对人卵巢癌SKOV3细胞中Bub1基因的抑制作用,并探讨其对SKOV3细胞紫杉醇敏感性的影响.方法 构建pEGFP-Bub1-shRNA质粒,将其经脂质体Lipo 2000TM转染SKOV3细胞后,通过RT-PCR及Western blot检测干扰效率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,MTT法比较转染前后SKOV3细胞的紫杉醇敏感性.结果 成功构建了pEGFP-Bub1-shRNA质粒;RT-PCR 和Western blot检测结果提示,转染后Bub1的mRNA和蛋白表达均显著降低;MTT和FACS提示,与对照组细胞相比,转染后SKOV3细胞生长抑制率及凋亡率明显降低(P<0.05).结论 pEGFP-Bub1-shRNA质粒能有效抑制Bub1 mRNA及蛋白的表达,并降低SKOV3细胞紫杉醇敏感性,该质粒的成功构建为进一步研究Bub1基因的生物学功能提供了工具.     

人乳头状瘤病毒18型阳性肿瘤疫苗的构建及体外活性鉴定

目的: 制备人乳头状瘤病毒（human papilloma virus, HPV）18型阳性的肿瘤疫苗，并观察其体外活性。方法:利用昆虫杆状病毒(简称Bac to Bac)表达系统，将HPV18L1基因重组入穿梭质粒pFastBacHtb，构建HPV18 L1Htb，通过转座反应,将目的基因片段重组入杆状病毒基因     

GRP78在三种不同乳腺癌细胞的表达及其意义

目的：探讨葡萄糖调节蛋白78（GRP78）在高低转移对的乳腺癌细胞的表达及其意义。方法：分别采用半定量RT-PCR，蛋白免疫印迹法和细胞免疫荧光方法检测GRP78在三种不同乳腺癌细胞株（MDA-MB-231、435S和MCF-7）的mRNA蛋白表达及其亚细胞定位情况，结果：GRP78mRNA和蛋白在（MDA-MB-231细胞的表达最高，其次为（MDA-MB-435S，在MCF-7的表达最低；共聚焦显微镜下观察到GRP78蛋白主要定位在细胞浆，在细胞膜以及细胞核内也有少量的表达，，结论：GRit／8是乳腺癌的一个促癌基因，在乳腺癌的发生、发展过程中发挥着重要作用，其可作为抗乳腺腺癌治疗的一个新的分子靶点。