应用功能分类基因芯片筛选卵巢癌淋巴结定向高转移细胞系中差异性表达基因

目的:在裸鼠体内建立以人卵巢浆液性乳头状腺癌细胞系SKOV3具有淋巴结定向高转移亚克隆第二代SKOV3-pm2、第三代SKOV3-pm3细胞系,应用基因芯片技术比较这3种具有不同淋巴结定向转移能力的细胞亚系中基因表达谱的差异,寻找卵巢癌侵袭转移相关基因.方法:采用Trizol一步法抽提SKOV3、SKOV3-pm2、SKOV3-pm3 3种细胞总RNA;取等量RNA逆转录合成cDNA用Ampolabeling-LPR(linear polymerase reaction,线性聚合酶反应)法标记的cDNA链做探针,混合后与功能分类基因芯片[Oligo Tumor Metastasis Microarray Catalog No.OHS-028(人)]杂交,计算机分析后比较3种细胞中差异性表达基因,并应用RT-PCR技术对其中3个表达差异明显的基因进行验证.结果:共筛选出表达差异性基因60个,其中表达上调基因47个(ratio＞3),有21个基因在SKOV3-pm2、SKOV3-pin3中共同表达上调;表达下调基因13个(ratio＜0.5),有1个基因在SKOV3-pm2、SKOV3-pm3细胞中共同表达下调.结论:基因表达芯片检测与肿瘤淋巴体外转移模型相结合,为肿瘤转移研究提供了新方法、新思路.     

卵巢癌细胞与卵巢癌淋巴定向高转移细胞分泌蛋白差异初筛

目的:分析卵巢癌细胞株(SKOV3)与卵巢癌淋巴结定向高转移细胞株(SKOV3-PM4)分泌蛋白的差异,寻找与卵巢癌淋巴定向转移密切相关的潜在诊断分子标志。方法:分别收集SKOV3与SKOV3-PM4培养上清,利用双向凝胶电泳(2-DE)及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI_T0F-MS/MS)技术筛选及鉴定差异表达的蛋白点,对其进行生物学分析后采用蛋白质印迹法验证挑选目标蛋白在细胞分泌蛋白中的表达情况。结果:二维凝胶电泳显示,SK-OV3细胞分泌蛋白质点数约为569±156,SKOV3-PM4细胞分泌蛋白质点数约为598±175。选取差异较大的7个差异蛋白点进行MS+MS/MS质谱鉴定,分别为乙二醛酶1(GLO1)、翻译后调节肿瘤蛋白(TPTC)、二磷酸核苷激酶B(ND-PK-B)、膜联蛋白(ANXA1)、热休克蛋白27(HSP)、过氧化物氧化还原(PRDX1)和磷脂酰乙醇胺结合蛋白Ⅰ(PEBP-Ⅰ)。挑选NDPK-B、ANXA1和HSP蛋白经蛋白质印迹法验证发现,SKOV3-PM4细胞中ANXA1和HSP27表达高于SKOV3细胞,而NDPK-B表达低于SKOV3细胞。与质谱分析的结果基本一致。结论:在卵巢癌细胞与卵巢癌淋巴结定向高转移细胞之间分泌蛋白存在很大的差异,其中已被鉴定的ANXA1和HSP27与卵巢癌淋巴结转移密切相关,有望成为诊断或预测卵巢癌淋巴结转移患者血清检测的标志。     

淋巴管内皮细胞微环境对卵巢癌淋巴结定向高转移细胞上皮-间质转化的影响

目的通过人卵巢癌淋巴结定向高转移的细胞株（SKOV3-PM4）与人淋巴管内皮细胞株（HLEC）的条件培养和共培养,探讨HLEC微环境对SKOV3-PM4的运动迁移能力以及上皮一间质转化（EMT）的影响。方法采用transwell小室体外侵袭法,观察经HLEC的条件培养后SKOV3．PM4的侵袭、迁移能力的改变。SKOV3-PM4经HLEC的条件培养和共培养后的爬片细胞,采用免疫组化法检测转化生长因子（TGF-β1）、E．钙黏蛋白（E．cadherin）、波形蛋白（vimentin）表达的变化。结果经HLEC培养基的条件培养后SKOV3-PM4细胞的侵袭率为（53＋11）％,单独培养的SKOV3-PM4细胞的侵袭率为（30~5）％（P〈0．05）;条件培养后SKOV3-PM4细胞的迁移率为（48＋5）％,单独培养的SKOV3-PM4细胞的迁移率为（34＋2）％（P〈0．05）。SKOV3．PM4细胞经条件培养和共培养后TGF—B。和vimentin表达上调（P均〈0．05）,E—cadherin表达下调（尸〈0．05）。结论淋巴管内皮细胞微环境可促进卵巢癌淋巴结定向高转移细胞间质化的转变,增强卵巢癌细胞的侵袭、迁移能力。     

糖尿病前期人群生活行为干预效果分析

目的探讨综合生活行为干预对糖尿病前期人群血糖和疾病转归的影响。方法将通过健康体检筛选出的210例糖尿病前期患者随机分为对照组和生活方式干预组。对照组仅给予一般健康教育;生活方式干预组给予饮食和运动方式指导。随访2 a。结果干预2 a后,生活方式干预组患者血糖、血压、体质量指数、总胆固醇均明显低于对照组（P〈0.05）,生活行为习惯有明显改善。生活方式干预组中仅12例（10.9%）发展为糖尿病,而对照组共46例（46.0%）进展为糖尿病。生活方式干预组逆转为正常糖耐量的比例高于对照组（33.6%vs 2.0%）（P〈0.05）。结论生活方式干预有助于糖尿病前期人群逐步建立健康的生活行为,降低糖尿病前期人群糖尿病的发生率,增加正常糖耐量的逆转率。     

血管内皮细胞对卵巢癌淋巴结定向转移细胞侵袭能力的影响

目的:研究血管内皮细胞对卵巢癌淋巴结高转移细胞的运动迁移和侵袭能力的影响。方法:建立卵巢癌淋巴结高转移细胞(SKOV3-PM4)、人脐血管内皮细胞(human umbilical venous endothelial cells,HUVEC)条件培养基的交互培养体系,通过MTT法测定生长曲线,HE染色观察细胞超微结构的改变,Transwell穿膜运动实验、划痕实验、明胶酶谱分析等实验方法研究交互培养后各组细胞的侵袭转移能力的变化。结果:与同期单独培养的SKOV3-PM4、HUVEC相比,交互培养后的SK-OV3-PM4伪足增多,生长速度明显快于SKOV3-PM4,交互培养后HUVEC呈不规则形态,出现空泡化超微结构,生长速度与HUVEC相似,细胞的运动和侵袭能力增强,基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)在单独的SKOV3-PM4中低表达,在HUVEC中不表达,在共培养的SKOV3-PM4-HUVEC中高表达。结论:HUVEC上清液培养后的SKOV3-PM4的生物学行为和运动侵袭能力发生改变,推测可能与血管内皮分泌的VEGF、MMP-2等因子有关。     

人淋巴管内皮细胞对卵巢癌淋巴结定向转移细胞分泌蛋白表达的分析

  目的  初步探讨人淋巴管内皮细胞(HLEC)对卵巢癌淋巴结定向转移细胞(SKOV3-PM4)分泌蛋白的影响。  方法  将细胞体系分为4组(A组:SKOV3;B组:SKOV3 + HLEC;C组:SKOV3-PM4;D组:SKOV3-PM4 + HLEC),采用抗体芯片和iTRAQ-2D-LC-MALDI-TOF/TOF/MS方法检测各组细胞培养基中的蛋白,筛选出差异明显的分泌蛋白,对其行生物信息学分析,并采用ELISA方法在人血清标本和细胞培养基中进行验证。  结果  抗体芯片与质谱分析结果提示,C组与A组相比、D组与C组相比Progranulin(GRN)、VEGFA表达上调,SPARC、IGFBP7表达下调。经过综合生物信息学分析,IGFBP7和VEGFA联系紧密,相互影响。与正常组血清相比,VEGFA在卵巢癌中的表达最高,IGFBP7表达最低,差异有统计学意义(P < 0.05)。  结论  淋巴结定向转移与淋巴管内皮细胞微环境关系密切,共培养后的差异蛋白涉及到基质细胞蛋白、细胞黏附作用因子等方面。其中VEGFA、GRN的表达上调及SPARC、IGFBP7的表达下调与卵巢癌淋巴结定向高转移密切相关。      

应用SELDI-TOF-MS技术筛选卵巢癌淋巴结定向高转移特性细胞株差异表达蛋白

背景与目的:人卵巢浆液性乳头状腺癌细胞株SKOV3及其在裸鼠体内建立的淋巴结定向高转移亚克降第二代SKOV3-pm2、第三代SKOV3-pm3细胞株,为卵巢癌转移分子机制的研究提供了细胞模型.本研究应用飞行时间质谱技术结合蛋白芯片分析筛选卵巢癌淋巴结定向高转移与非定向转移细胞株之间的蛋白质表达差异.方法:采用动物实验测定SKOV3、SKOV3-pm2和SKOV3-pm3三种细胞株的淋巴结转移率.应用表面增强激光解吸离子化-飞行时间质谱(surface-enhanced laser desorption and ionization-time of flight-mass spectrometry,SELDI-TOF-MS)技术检测各细胞株提取的胞浆总蛋白和分泌蛋白,每种细胞分别采用CM-10型弱阳离子交换芯片和IMAC-3型固定金属亲和芯片检测.应用Ciphergen Protein Software 3.2.0软件和Biomarker Wizard软件对采集3组细胞的蛋白峰进行比较.峰强度相差0.5倍以上者定义为差异蛋白.结果:动物实验显示.细胞株SKOV3及高转移亚克隆SKOV3-pm2、SKOV3-pm3的淋巴结转移率分别为20%、90%和100%,前者与后二者之间的差异有统计学意义(P<0.05).获得CM-10和IMAC3两种蛋白芯片上SKOV3、SKOV3-pm2、SKOV3-pm3细胞株蛋白质谱图谱,对比发现:质荷比(m/z)为6971、7475、9089、9453、10 103、11 655的胞浆蛋白及质荷比(m/z)为4746的分泌蛋白在上述三种细胞株中存在不同程度差异表达.结论:应用SELDI-TOF-MS技术结合固定金属亲和芯片和弱阳离子交换芯片,可有效筛选卵巢癌淋巴结定向高转移特性细胞株中的特异性表达蛋白;寻找到的差异蛋白与淋巴结定向高转移潜能密切相关.     

下肢外骨骼机器人康复训练对脑卒中偏瘫患者下肢运动的影响

目的 探讨下肢外骨骼机器人康复训练对脑卒中偏瘫患者下肢运动功能的影响。 方法 收集54例发病12个月内的脑卒中偏瘫患者,分为试验组27例和对照组27例。对照组患者进行常规康复训练及步行训练,试验组患者进行常规康复训练及下肢外骨骼机器人步行训练。分别于治疗前、治疗2周后和治疗4周后予以步行功能评估,包括6 min步行试验(6MWT)、10 m步行测试(10MWT)和功能性步行分级(FAC);Fugl-Meyer下肢运动评定量表(FMA-LE)评估下肢运动功能;使用运动捕捉系统采集患者的步态时空参数。通过以上各项指标分析两组患者下肢运动功能的变化情况。 结果 (1) 治疗2周和4周后,试验组和对照组患者6MWT、10MWT组内较治疗前均有明显提高,差异有统计学意义(P均<0.05);治疗4周后,两组患者6MWT与治疗2周组内相比有进一步提高,差异有统计学意义(P均<0.001),仅试验组患者10MWT组内较治疗2周比较,差异有统计学意义(P=0.008 5);(2) 治疗2周和4周后,试验组和对照组FAC评级和FMA-LE评分组内较治疗前相比有明显改善,差异有统计学意义(P均<0.01),两组治疗4周后FMA-LE较2周时有更进一步改善,差异有统计学意义(P均<0.001);(3) 治疗4周后,试验组步行周期较治疗前(P=0.003 5)、2周后(P=0.003 2)相比,差异有统计学意义。 结论 下肢外骨骼机器人可有效改善脑卒中偏瘫患者的下肢运动功能、步行功能和步行周期,其疗效与常规步行训练相当。