C3d-P28增强乙型肝炎病毒特异性基因免疫效果的研究

目的　观察补体C3d P2 8对基因免疫的调节作用及其不同拷贝数对调节作用的影响 ,为增强基因免疫效果寻求新方法。方法　PCR法获得补体C3d P2 8编码基因并以头尾串连方式将1～ 4拷贝C3d P2 8编码基因克隆至pVAON33,构建pVAON33 P2 8.[1～ 4 ]重组质粒 ,然后将HBV preS2 S编码基因分别插入pVAON33和pVAON33 P2 8.[1～ 4 ]质粒获得pVAON33 S2 S和pVAON33 S2 S P2 8.[1～ 4 ]重组质粒。肌肉注射各重组质粒DNA(每只 10 0 μg 10 0 μl)初次免疫小鼠 ,并以pVAON33为对照 ;12周后皮下注射HBsAg蛋白加强免疫各组小鼠 ,ELISA法检测免疫小鼠血清特异性抗 HBs IgG。结果　pVAON33 S2 S重组质粒免疫小鼠可诱导产生特异性抗 HBs IgG ,含不同拷贝C3d P2 8编码基因的重组质粒可诱导更高的特异性抗体 ,其中pVAON33 S2 S P2 8.4重组质粒诱导的抗体水平最高 (P <0 .0 1)。蛋白加强免疫后 ,含C3d P2 8编码基因重组质粒免疫组抗 HBs IgG迅速上升 ,并明显高于pVAON33 S2 S重组质粒免疫组 (P <0 .0 5 ) ,pVAON33 S2 S P2 8.4重组质粒诱导的抗体仍维持最高水平。结论　不同拷贝的C3d P2 8能不同程度地增强HBV preS2 S基因免疫诱导的特异性体液免疫及其蛋白加强后的回忆反应 ,其中 4拷贝C3d P2 8的增强作用较为显著。     

SARS-Cov M蛋白的真核表达及其免疫原性研究

目的初步研究SARS-Cov病毒M蛋白基因的真核表达效率和免疫原性为进一步的疫苗研究奠定基础。方法以PCR方法在全病毒基因组文库中获得全长M基因,分别克隆至pcDNA4-his／myc和pVAON33载体获得重组质粒pcDNA4-his／myc-M和pVAON33-M。以Western Blot方法利用融合分子羧基段的myc表位检测pcDNA4-his／myc-M转染的293T细胞中M蛋白的真核表达。以ELISA方法检测pVAON33-M质粒基因免疫小鼠诱导产生特异性抗血清。结果pcDNA4-his／myc-M转染后48h可检测到SARS-Cov M蛋白表达。pVAON33-M基因免疫能够诱导产生M特异的体液免疫应答。结论本研究的结果表明SARS-Cov M蛋白可以在真核细胞中有效表达并有良好免疫原性,可以作为SARS-Cov疫苗研制的候选抗原之一。     

ehCGβ肿瘤基因疫苗诱生抗体的抗肿瘤作用

目的：探讨ehCGβ肿瘤基因疫苗诱生抗hCGβ抗体的抗肿瘤作用。方法：以TR421ehCGβ质粒实施基因免疫、空载质粒为对照，ELISA法检测免疫小鼠血清中特异性抗hCGβIgG抗体；以3HTdR掺入法检测灭活补体前后免疫血清对ehCG+肿瘤细胞增殖活性的抑制作用；倒置显微镜和FACS分别观察Hela细胞的形态变化及细胞凋亡情况。结果：TR421ehCGβ质粒诱导小鼠产生高水平抗hCGβIgG抗体；抗hCGβ免疫血清对Hela细胞的抑制增殖作用明显强于对照血清，灭活补体后抑制率无明显变化；免疫血清的抑制作用与肿瘤细胞的hCGβ表达水平有一定的相关性；Hela细胞与免疫血清孵育后细胞死亡明显增多，但其中凋亡细胞为3.42%，与对照血清孵育细胞的凋亡（1.88%）比较无明显差异。结论：ehCGβ肿瘤基因疫苗诱生的抗hCGβ抗体以不依赖补体方式抑制ehCGβ+肿瘤细胞的增殖。     

C3d-P28对基因免疫诱导的HBV特异性细胞免疫应答的调节作用

目的：观察补体C3d-P28对基因免疫诱导的HBV特异性细胞免疫应答的调节作用，为增强基因免疫效果寻求新方法。方法：将质粒pVAON33-S2／S质粒(仅含HBV-preS2／S编码基因)和pVAON33-S2／S-P28．4质粒(含HBV-prS2/S和4拷贝C3d-P28的编码基因)以肌肉注射法对BALB／C小鼠实施基因免疫(100μg/100μl只)，并以空载质粒为对照。定期采集免疫小鼠血清、ELISA法检测其中特异性抗HBs-IgG及其亚型的水平；免疫小鼠脾细胞经特异性抗原(HBsAg)刺激后，采用，H-TdR掺入法、半定量RT-PCR法、同位素释放法分别检测其特异性淋巴细胞增殖活性、IL-4和IFN-γ基因表达的水平、CTL杀伤活性。结果：pVAON33-S2／S-P28．4质粒基因免疫诱导的特异性淋巴细胞增殖活性、抗HBs-IgG水平以及特异性CTL杀伤活性均明显高于pVAON33-S2／S质粒；C3d-P28未改变基因免疫诱导的抗HBs-IgG各亚型水平的格局，同时增强IgG1、IgG2a、IgG2b的水平；pVAON33-S2／S-P28．4质粒诱导的IL-4和IFN-γ的基因表达水平均明显高于pVAON33-S2／S质粒。结论：C3d-P28可在提高体液免疫应答的同时增强基因免疫诱导的HBV特异性细胞免疫应答。     

HBV-preS2/S-C3d联合基因疫苗诱导的特异性免疫应答及其意义

目的：研究HBV—preS2／S—C3d联合基因疫苗诱导的特异性体液和细胞免疫应答及其意义。方法：CR2结合实验检测C3d融合蛋白的结合特性；分别用TR421、TR421-preS2／S和TR421—preS2／S—C3d3重组质粒免疫小鼠．ELISA法检测特异性抗HBs—IgG的亲合力，^3H-TdR掺入法检测其特异性淋巴细胞增殖活性（SI），半定量RT—PCR法检测IL-4、IFN-γ、T—bet和GATA-3基因表达的水平。结果：C3d融合蛋白可有效地结合CR2；TR421—preS2／S—C3d3质粒基因免疫诱导的抗HBs—IgG水平、亲合力以及SI均明显高于TR421-preS2／S组，并且前者诱导的IL-4、IFN-γ、T—bet和GATA-3基因表达水平也均高于后者。结论：C3d通过结合CR2、上调IL-4和转录因子的表达、促进抗体亲合力成熟来增强基因免疫诱导的HBV特异性免疫应答。     

异位hCGβ-CTP37基因疫苗的抗肿瘤作用

目的 :研究异位hCGβ CTP37基因免疫诱导的肿瘤特异性免疫应答及其抗肿瘤作用 ,为肿瘤的免疫生物治疗寻求新途径。方法 :分离获取异位hCGβ CTP37的编码基因 ,并将 4拷贝基因以头尾串联形式克隆于真核表达载体TR42 1构建重组质粒TR42 1 CTP37.4,以PCR、酶切和DNA序列测定进行鉴定 ;肌内注射法对BALB/c小鼠实施 3次基因免疫 (1 0 0 μg/ 1 0 0 μl) (每只小鼠 ) ,间隔 3周 ,并以空载质粒为对照。ELISA法检测免疫小鼠血清中特异性抗hCGβ IgG抗体 ;免疫小鼠脾细胞经特异性抗原hCGβ刺激后 ,用3H TdR掺入法和同位素释放法分别检测其特异性淋巴细胞增殖活性和CTL细胞毒活性 ;皮下接种SP2 / 0 hCGβ细胞攻击免疫小鼠 ,以成瘤率及实体瘤重量评估体内抗瘤效果。结果 :TR42 1 CTP37.4质粒免疫小鼠产生了较高水平的抗hCGβ IgG抗体 ,与空载质粒组有显著差异 ;hCGβ蛋白刺激TR42 1 CTP37.4质粒免疫小鼠脾细胞生产了高水平的特异性淋巴细胞增殖活性 ,且明显高于空载质粒免疫小鼠 ;特异抗原诱导的TR42 1 CTP37.4质粒免疫小鼠脾细胞对SP2 / 0 hCGβ细胞的CTL活性明显高于SP2 / 0 preS2 /S细胞 P <0 .0 1 ) ;空质粒免疫小鼠接种SP2 / 0 hCGβ细胞后成瘤率为 1 0 0 % ,瘤重达 3 .37g,而TR42 1 CTP37.4质粒免     

CD40L在M2型巨噬细胞类型转换中的作用

 目的 检测不同CD40L表达水平的脾细胞对巨噬细胞表型和功能的影响,探讨通过调控CD40L的表达改变巨噬细胞的类型。方法 贴壁分离正常BALB/c小鼠的腹腔巨噬细胞。将腹腔巨噬细胞或经IL-4刺激的腹腔巨噬细胞,分别与体外培养2日后获得的CD40Llow脾细胞和Ionomycin与PMA诱导的CD40Lhigh脾细胞共孵育,24h后检测M1和M2型巨噬细胞相关基因的表达,并以硝酸还原酶法检测NO分泌水平。结果 与CD40Llow脾细胞共孵育的巨噬细胞CCL22、Fizz1和Ym1表达水平较高,但只分泌较低水平的NO,而与CD40Lhigh脾细胞共孵育的巨噬细胞表达较高水平的CCL3并分泌高水平的NO,而且CD40Lhigh脾细胞可使M2型巨噬细胞表型相关基因明显下调。结论 CD40Lhigh脾细胞使巨噬细胞倾向于M1型极化,并且能使M2型巨噬细胞向M1型转换。     

C3d-P28增强乙肝病毒基因免疫诱导的特异性细胞免疫应答

目的 :研究补体C3d中P2 8分子对HBV基因免疫诱导的细胞免疫应答的调节作用 ,为增强基因疫苗细胞免疫的效果寻求新方法。方法 :分别分离获取C3d P2 8和HBV preS2 /S编码基因 ,并克隆入真核表达载体 pVAON33中 ,构建相应重组质粒pVAON33 S2 /S (仅含HBV preS2 /S编码基因 )和pVAON33 S2 /S P2 8.4 (含HBV preS2 /S和 4拷贝C3d P2 8的编码基因 ) ,并以PCR、酶切和DNA序列测定进行鉴定。以肌肉注射法对BALB/c小鼠实施 3次基因免疫 ( 10 0 μg/10 0 μL·只 ) ,间隔 3wk ,并以空质粒免疫小鼠作为对照。免疫小鼠脾细胞体外经HBsAg刺激后 ,用3 H TdR掺入法和同位素释放法 ,分别检测特异性淋巴细胞增殖和CTL杀伤活性。结果 :pVAON33 S2 /S和 pVAON33 S2 /S P2 8.4免疫小鼠的脾细胞 ,均显示较强的特异性增殖活性和CTL杀伤活性 ,但后者显著强于前者 (P <0 .0 5 )。结论 :C3d P2 8可增强HBV preS2 /S基因免疫诱导的特异性细胞免疫应答     

体内电转染增强基因免疫诱导的HBV特异性体液免疫应答

为观察体内电转染对HBV基因免疫诱导的特异性体液免疫应答的调节作用,将HBV-preS2/S编码基因插入pVAON33载体构建重组质粒pVAON33-preS2/S,运用肌肉注射法对BALB/c小鼠进行基因免疫(100ug质粒DNA.100ul.只)。以pVAON33-preS2/S、pVAON33-preS2/S(体内电转染)为实验组,并以pVAON33空质粒为对照。按期采集免疫小鼠血清。采用ELISA法检测免疫小鼠血清特异性抗HBs-IgG抗体。结果显示,pVAON33-preS2/S免疫小鼠后可诱导产生特异性抗HBs-IgG抗体,到第7周时其OD值为0.73±0.18(P/N为2.13),而pVAON33-preS2/S(体内电转染)组诱导了更高水平的特异性抗HBs-IgG抗体,第7周时OD值为1.30±0.45(P/N为3.79),两组比较有显著性差异(P<0.05)。本研究表明体内电转染可明显增强HBV基因免疫诱导的体液免疫应答。