原代小鼠肝细胞培养方法的比较

目的: 比较3种不同培养条件下原代小鼠肝细胞的形态以及肝细胞功能,寻找适合于原代小鼠肝细胞体外培养的培养基配方。方法: 采用改良Seglen两步胶原酶灌注法分离原代小鼠肝细胞,糖原染色观察细胞纯度,在贴壁4 h后用基础培养基、基础培养基加DMSO(DMSO组)、基础培养基加DMSO和EGF(DMSO+EGF组)等3种不同的条件培养肝细胞。镜下观察肝细胞形态,用MTT法检测细胞活力,生化分析仪检测细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)水平以及用ELISA法检测细胞培养上清液中白蛋白水平。结果: 成功分离小鼠原代肝细胞,肝细胞纯度达95%以上;原代肝细胞培养至96 h时,DMSO组仍能较好地维持细胞形态,基础培养基组的细胞活力比DMSO组和DMSO+EGF组分别降低了66.87%和67.16%(P<0.05),且基础培养基组的LDH水平均高于DMSO组和DMSO+EGF组(P<0.05)。此外DMSO组在96 h时仍能维持较高水平的白蛋白分泌,比基础培养基组和DMSO+EGF组分别增加了185%和24.2% (P<0.05)。结论: 小鼠原代肝细胞培养基中加入DMSO对于维持肝细胞的形态和功能有促进作用,本研究为体外原代肝细胞培养模型的建立和优化提供了实用的方法。     

分次低剂量电离辐射在诱导EA.hy926细胞衰老中的作用

目的 探讨分次低剂量电离辐射(LDIR)在诱导EA.hy926细胞衰老中的作用机制。方法 将EA.hy926细胞分为0、50 mGy×4、100 mGy×4、200 mGy×4组,采用X射线辐照后分别培养24、48和72 h,检测细胞衰老相关β半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色、衰老相关的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂CDKN1A和CDKN2A基因mRNA水平、活性氧（ROS）、总抗氧化能力（T-AOC）、磷酸化H2A组蛋白变体X(γ-H2AX)水平。结果 LDIR辐照4次后,与对照组相比,24、48和72 h,各剂量组细胞核面积增大,细胞边缘模糊,SA-β-gal阳性面积均增加（P <0.05）;辐照4次后24和48 h,100 mGy×4组和200 mGy×4组的CDKN1A基因mRNA水平升高（P <0.05）,48和72 h,100 mGy×4组和200 mGy×4组CDKN2A基因mRNA水平升高（P <0.05）;辐照4次后24、48和72 h,各剂量组ROS荧光强度升高（P <0.05）;辐照4次后24 h,100 mGy×4组和200 mGy×4组...     

环境化学污染物 暴露相关基因甲基化焦磷酸测序方法的构建和应用

目的：构建适用于环境化学污染物暴露相关基因甲基化的焦磷酸测序方法，应用于检测多环芳烃暴露的焦炉工人外周血细胞DNA的基因甲基化修饰。方法：采用亚硫酸氢盐修饰后测序检测多环芳烃职业暴露工人外周血中RAS相关结构域家族基因1A（RASSF1A）的甲基化水平，选择对暴露因素响应明显，即在两组人群中存在显著统计学差异的甲基化位点较集中的片段作为甲基化敏感区域。针对该区域构建焦磷酸测序方法，并在焦炉工人中进行验证。结果：所构建的焦磷酸测序方法具有更快速、简便、准确及经济的特点，能有效区分多环芳烃职业暴露工人与对照工人，其中，焦炉暴露工人RASSF1A甲基化修饰水平升高了87.15%（暴露组为9.32%±3.82%，对照工人为4.98%±2.28%，P < 0.01）。结论：基于外源性化学物暴露人群的亚硫酸氢盐修饰后测序结果选取焦磷酸测序片段具有良好的化学物特异性和准确度，可用于职业暴露人群大样本DNA甲基化检测。     

癌症高发区环境水样有机提取物诱导L-02细胞转化及其表观遗传学机制

目的:检测华中某癌症高发地区环境水样有机提取物诱导人肝细胞系L-02细胞转化的能力,并初步探讨其诱导细胞转化的表观遗传学机制。方法:分别采集研究地区河水、离河较近(约1 km)及离河较远(约20 km)的浅井水(约10 m),用固相萃取方法提取其中的有机物。用台盼蓝染色计数法和单细胞凝胶电泳试验检测受试物的细胞毒性和致DNA损伤效应,以受试物对L-02细胞进行长期染毒并利用软琼脂克隆形成试验和裸鼠皮下成瘤试验检测受试物诱导L-02细胞转化的能力。采用甲基化特异性PCR(methyrlation specific PCR,MSP)技术检测转化细胞中O~6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O~6-methylguanine-DNA methyhransferase,MGMT)基因启动子区甲基化状况,并分别用实时荧光定量PCR和Western blot技术检测转化细胞MGMT mRNA和蛋白的表达水平。结果:河水、离河较近的井水、离河较远的井水的有机提取物处理L-02细胞24 h后,细胞存活率达70%的处理浓度分别为每毫升培养基30、150、200ml原水,且均含有致DNA损伤的物质。以此作为最高剂量对细胞进行长期染毒,12周以后各处理组细胞软琼脂克隆形成试验和裸鼠皮下成瘤试验均显示转化特性。MSP结果显示转化细胞中MGMT基因启动子区发生高甲基化,与DMSO溶剂对照组比较,转化细胞中MGMT mRNA和蛋白表达水平均下调(P0.05)。结论:研究地区环境水样有机提取物具有诱导L-02细胞转化的能力,MGMT基因启动子区的高甲基化可能参与有机物诱导的细胞转化过程。     

全基因组扩增技术对DNA甲基化保真性的影响

目的： 采用焦磷酸测序技术对全基因组扩增后DNA甲基化保真性进行研究。方法：采用全基因组扩增试剂盒对L02、A549和HCT116细胞进行全基因组亚硫酸氢盐修饰后的DNA扩增,选择3个特异基因 (MGMT、GSTP1和P16)和反映基因组总甲基化水平的LINE1序列,利用焦磷酸测序技术检验扩增前后甲基化的保真性。结果：DNA平均扩增量为246倍,片段长度>1 000 bp,符合甲基化检测的基本要求。反映总甲基化水平的LINE1在扩增前后无明显变化;扩增后3个特异基因甲基化的变化幅度与扩增前基因甲基化水平相关。当基因的甲基化水平≥60%时,其扩增前后变化不大;当基因甲基化水平在≥20%~60%之间时,扩增前后的变化较大,且无一致的变化趋势;而当基因甲基化水平低于<20%时,扩增后基因甲基化水平下降显著。此外,焦磷酸测序结果表明全基因组扩增对各特异基因多个CpG甲基化位点的影响与对该基因平均甲基化水平的影响一致。结论：全基因组亚硫酸氢盐修饰后的DNA扩增适用于基因整体甲基化水平和甲基化率≥60%的特异基因的甲基化研究,但会影响低DNA甲基化率基因 (<60%)的DNA甲基化的保真性。     

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸及其前体防治衰老相关疾病作用机制研究进展

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+）是多种脱氢酶的辅酶，在糖酵解、三羧酸循环等生理过程中发挥着重要作用，并参与能量代谢、蛋白质翻译和修饰、DNA修复和细胞应激等多种生物过程以对抗疾病。大量研究显示，衰老伴随着细胞和组织NAD+水平的下降，而这种下降与代谢性疾病、神经退行性疾病、免疫炎症、肿瘤等许多衰老相关疾病存在因果关系。NAD+及其前体（烟酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖等）在延缓衰老、防治许多衰老相关疾病等方面具有重要作用。本文主要综述了逆转NAD+年龄依赖性下降防治衰老相关疾病的调控机制，并简述了NAD+代谢、NAD+前体功能及有效补充NAD+的途径，为衰老相关疾病的预防和治疗方案提供参考。