二氟甲基鸟氨酸对T淋巴瘤Jurkat细胞生长的影响

目的研究二氟甲基鸟氨酸(difluromethylornithine,DFMO)对人T淋巴瘤Jurkat细胞的影响及其作用机制,为探讨DFMO能否用于治疗人白血病提供实验依据。方法DFMO(0～10mmol/L)处理人T淋巴瘤Jurkat细胞24～72h后,MTS法检测细胞的存活率,化学分析法检测精胺氧化酶(spermine oxidase,SMO)和乙酰多胺氧化酶(acetylpolyamine oxidase,APAO)活性,DNA片段化分析检测细胞凋亡,荧光染料法检测细胞线粒体膜电位变化,Western blot法检测细胞内Bax含量,分光光度法检测caspase-3酶活性。结果DFMO处理细胞能显著抑制Jurkat细胞的生长(P<0.01),抑制率随药物浓度的增加和作用时间的延长而加大,DFMO浓度为10mmol/L时,24h抑制率为33%,48h抑制率为38%,72h抑制率为49%。DFMO处理可导致Jurkat细胞DNA片段化,促进Bax由细胞质向线粒体转移,细胞内caspase-3活性增加(增加46%,P<0.05),并伴有线粒体膜电位的显著降低,DFMO浓液为2和5mmol/L时,分别降低29...     

用SiRNA沉默SSAT基因表达降低人A549肺癌细胞对抗癌多胺类似物CPENSpm的敏感性

导师陈少春是杭州市中医院主任医师,硕士生导师,曾师从已故国家级名中医何子淮主任医师,现任浙江省中医学会妇科专业委员会委员。从事中医妇科临床医疗和科研工作40余年,擅长治疗各种妇科杂病。笔者跟师期间,受益良多。本文就陈师从肝论治妇科病经验总结如下。     

多胺类似物BENS对黑素瘤B16-F1细胞生长的影响

目的:探讨多胺类似物N1,N11-bis(ethyl)norspermine(BENS)对黑素瘤B16-F1细胞生长及凋亡的影响.方法:BENS处理B16-F1细胞,MTT法检测细胞存活率,FCM法检测细胞凋亡率,荧光染色法检测线粒体膜电位的变化,DNA片段化检测细胞凋亡,Western印迹法检测凋亡相关蛋白的含量.结果:多胺类似物BENS能显著抑制B16-F1细胞增殖,抑制率呈药物浓度依赖性.BENS可诱导DNA片段化,导致FCM分析中出现典型的亚凋亡峰,同时伴有细胞线粒体膜电位降低、细胞色素C由线粒体向细胞质释放和Bax由细胞质向线粒体转移等凋亡相关性改变.结论:多胺类似物BENS抑制黑素瘤B16-F1细胞生长,并能诱导该细胞凋亡,具有潜在的临床应用价值.     

精胺/精眯N1-乙酰基转移酶重组蛋白的原核表达及其抗体制备

目的 探讨精胺/精眯N1乙酰基转移酶(SSAT)的原核表达及抗SSAT多克隆抗体的制备.方法 RT-PCR法从人肺癌细胞总RNA中克隆SSAT cDNA后,构建SSAT原核表达质粒pET15b/SSAT并转化BL21(DE3)大肠杆茵细胞.SSAT重组蛋白经IPTG诱导表达后,利用PAGE凝胶纯化和Ni-NTA亲和层析纯化.用凝胶纯化的SSAT重组蛋白免疫家兔以制备抗SSAT多克隆抗体,所得抗体的特异性及效价用Western blot和ELISA技术检测.结果 SSAT重组蛋白可在大肠杆茵中诱导性高表达,用此蛋白免疫动物所得的SSAT抗体的效价以及特异性均较高.结论 建立了SSAT原核表达系统并成功制备出SSAT多克隆抗体.     

siRNA抑制精胺氧化酶的表达可降低人A549肺癌细胞对多胺类似物CPENSpm的敏感性

目的研究精胺氧化酶(spermine oxidase,SMO)基因表达抑制对多胺类似物CPENSpm抗瘤活性的影响。方法用siRNA技术获得SMO基因表达抑制的人A549肺癌细胞株,QT-RT-PCR法和酶活性分析法用于鉴定SMO基因的表达水平,MTT法检测细胞的存活率,DNA降解分析和流式细胞/亚凋亡峰分析检测细胞凋亡状况。结果成功获得SMO基因表达抑制的人A549肺癌细胞株。用SMO-siRNA质粒转染的细胞中,SMO mRNA和酶活性的基础水平分别降低53%和14%。用10μmol·L-1 CPENSpm处理对照细胞24h可使SMO mRNA和酶活性分别升高10倍和20倍,但在SMO-siRNA质粒转染的细胞中,这种药物对SMO的表达诱导被抑制。细胞增殖实验发现,SMO表达抑制的细胞对CPENSpm(0～20μmol·L-1)的药物敏感性低于对照细胞。细胞凋亡分析发现,与对照细胞相比,CPENSpm诱导SMO表达,抑制细胞发生细胞凋亡的能力明显减弱。结论CPENSpm诱导肿瘤细胞内SMO高表达可能是其抗癌药理活性的分子基础之一。     

小鼠钙网蛋白的克隆与原核表达

目的:克隆小鼠钙网蛋白(CRT)并在E.coli中原核表达和纯化.方法:采用RT-PCR法从昆明鼠肝总RNA中克隆小鼠钙CRT cDNA,构建CRT原核表达质粒(pET-15b/CRT)并转化E. coli的Rossetta(DE3)菌株.IPTG诱导后,表达蛋白在变性条件下经Ni-NTA树脂亲和层析纯化,然后透析复性.分别用SDS-PAGE和Westem blot法鉴定CRT的表达和纯化.结果:从昆明鼠肝总RNA中成功克隆获得小鼠CRTcDNA,该cDNA序列被成功克隆入pET-15b原核表达载体.DNA测序表明,重组质粒pET-15b/CRT构建正确.转化pET-15b/CRT的E.coli,Rossetta(DE3)能够诱导性表达重组小鼠CRT蛋白,该蛋白可经Ni-NTA树脂亲和层析高度纯化.结论:成功克隆昆明小鼠CRT cDNA并建立了小鼠CRT原核表达和纯化的实验方法,为后续的CRT蛋白功能研究奠定了基础.     

细胞膜上稳定表达融合蛋白CRT/vGPCR A549细胞株的建立

目的 将人钙网蛋白(calreticulin,CRT)基因与病毒G蛋白偶联受体(virus G-protein couple receptor,vGPCR)基因进行基因重组,用此重组基因建立细胞膜上稳定高表达CRT/vGPCR融合蛋白的人肺癌A549细胞株.方法 从pSG5-vGPCR质粒中获得全长vGPCR基因片段并与CRT全长编码序列的3′端连接形成融合基因,然后将融合基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中.用此质粒转染人A549肺癌细胞,通过G418筛选建立稳定转染的A549细胞株,用RT-PCR检测重组融合基因的表达,用细胞免疫荧光分析鉴定融合蛋白的表达及其在细胞膜上的定位.结果 成功获得重组融合质粒pcDNA3.1(+)-CRT/vGPCR,经DNA序列测定证实融合基因两阅读框(ORF)对接无误.将上述质粒转染A549细胞后,建立了稳定转染CRT/vGPCR的A549细胞株,融合基因在A549细胞中表达并定位到细胞膜上.结论 通过与CRT基因融合重组,具有膜定位能力的vGPCR能将CRT蛋白高效包被到肿瘤细胞膜上.     

精胺/精眯N1-乙酰基转移酶重组蛋白的原核表达及其抗体制备

目的 探讨精胺/精眯N¹乙酰基转移酶（SSAT）的原核表达及抗SSAT多克隆抗体的制备。方法 RT-PCR法从人肺癌细胞总RNA中克隆SSAT cDNA后,构建SSAT原核表达质粒pET15b/SSAT并转化BL21(DE3)大肠杆菌细胞。SSAT重组蛋白经IPTG诱导表达后,利用PAGE凝胶纯化和Ni-NTA亲和层析纯化。用凝胶纯化的SSAT重组蛋白免疫家兔以制备抗SSAT多克隆抗体,所得抗体的特异性及效价用Western blot和ELISA技术检测。结果 SSAT重组蛋白可在大肠杆菌中诱导性高表达,用此蛋白免疫动物所得的SSAT抗体的效价以及特异性均较高。结论 建立了SSAT原核表达系统并成功制备出SSAT多克隆抗体。     

融合基因CRT/vGPCR的构建及其在真核细胞膜上的表达

目的:将人钙网蛋白(CRT)基因与病毒G蛋白偶联受体(vGPCR)基因进行基因重组融合,由此将CRT携带到肿瘤细胞膜表面。方法:从pSG5-vGPCR质粒中获得全长vG-PCR基因片段并与CRT全长编码序列的3′端连接形成融合基因,然后将融合基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中。用此质粒转染人A549肺癌细胞后,用RT-PCR检测重组融合基因的表达,用免疫荧光细胞化学和流式细胞术分析鉴定融合蛋白的表达及其在细胞膜上的定位。结果:成功获得重组融合质粒pcDNA3.1(+)-CRT/vGPCR,经DNA序列测定证实融合基因两阅读框(ORF)对接无误。将上述质粒转染A549细胞后,融合基因可在A549细胞中表达并定位到细胞膜上。结论:通过与CRT基因融合重组,具有膜定位能力的vGPCR能将CRT蛋白高效包被到肿瘤细胞膜上。