参与连翘苯丙烷合成途径的WRKY转录因子的筛选与鉴定

目的 筛选出参与连翘Forsythia suspensa苯丙烷合成途径的WRKY转录因子并进行生物信息学分析。方法 通过对从连翘转录组数据中筛选出的62条连翘WRKY基因序列进行鉴定;通过采用蛋白理化性质和基序分析、蛋白结构分析、系统进化分析、功能注释、蛋白互作分析、外源激素处理后实时荧光定量分析等方式进行相关分析。结果 最终筛选出52条具有WRKY结构域的连翘WRKY转录因子。WRKY转录因子编码蛋白的氨基酸数目在105～728,相对分子质量在12277.95～80 321.99。蛋白基序分析显示其均有WRKY结构域,与拟南芥WRKY转录因子构建系统进化树将连翘52个WRKY转录因子进一步分为3大类;筛选出5个可能参与连翘苯丙烷合成途径的连翘WRKY转录因子,并推测其可能以被MAPK级联反应所调控的方式介导连翘中苯丙烷合成途径。结论 通过分析转录组测序结果,从52个连翘WRKY转录因子中筛选出5个可能参与连翘苯丙烷合成途径的转录因子,其表现出组织特异性表达,且对不同浓度茉莉酸甲脂表现出不同的响应,为进一步研究其作用机制提供研究方向。     

山茱萸萜类甲羟戊酸合成途径关键酶CoHMGS基因的克隆与分析

目的克隆得到山茱萸Cornusofficinalis萜类合成途径的关键酶CoHMGS基因的cDNA序列,并进行相应的生物信息学分析,为深入研究CoHMGS基因的功能奠定基础。方法以山茱萸转录组筛选出的c102453_g2序列为参考序列设计特异引物,以山茱萸叶片总RNA,通过RT-PCR扩增获得CoHMGS基因序列,序列纯化回收后连接到pTOPO-T载体上,转化至大肠杆菌DH10B,选取阳性克隆测序。利用生物信息学软件预测CoHMGS基因及其编码蛋白质的功能。结果克隆得到长度为1645 bp的CoHMGS序列,包含1413 bp的完整开放阅读框,编码470个氨基酸。蛋白整体带负电荷,为不稳定亲水性蛋白,定位于细胞质内,不含跨膜结构。结论首次克隆得到山茱萸CoHMGS基因,对其编码蛋白质进行了初步的分析和预测,为深入揭示CoHMGS基因在山茱萸萜类物质合成途径中的功能奠定了基础。     

山茱萸CoHMGR基因的亚细胞定位和表达分析

目的 研究山茱萸Cornus officinalis CoHMGR基因编码蛋白质的亚细胞定位以及不同浓度的外源激素对CoHMGR基因表达和活性成分含量的影响。方法 农杆菌菌液侵染烟草叶片,激光共聚焦倒置显微镜观察CoHMGR蛋白的亚细胞定位。不同浓度的茉莉酸甲酯和乙烯利喷施山茱萸2年生幼苗,实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)测定不同时期CoHMGR基因表达水平,高效液相色谱(HPLC)检测莫诺苷、马钱苷含量。结果 激光共聚焦显微镜下观察到CoHMGR蛋白定位于内质网中。qPCR和HPLC结果显示200 μmol/L茉莉酸甲酯和250 mg/L乙烯利对目的基因表达水平和活性成分含量都有正向诱导效应。结论 CoHMGR蛋白定位于内质网,外源喷施200 μmol/L茉莉酸甲酯和250 mg/L乙烯利能显著提高CoHMGR基因表达量和莫诺苷、马钱苷含量,为深入解析CoHMGR基因功能奠定基础。     

连翘多胺氧化酶基因家族的鉴定及干旱和盐胁迫下的表达分析

目的 研究连翘多胺氧化酶（polyamine oxidase,PAO）基因家族在盐和干旱胁迫下的响应特征。方法 通过分析连翘转录组数据鉴定出5个连翘PAO基因家族成员,结合蛋白质理化性质和基序分析、蛋白质结构分析、系统进化分析、结构域等方式进行相关性分析,并探究了盐和干旱胁迫下PAO基因的表达水平。结果 连翘PAO基因家族氨基酸数介于235～541 aa,相对分子质量在26 069～59 328,等电点在5.27～5.86;不稳定系数为35.68～44.14,总平均亲水性皆为负值,推测连翘PAO家族蛋白均为不稳定型、酸性、亲水性蛋白,α-螺旋与无规则卷曲为蛋白主要二级结构形式。结论 鉴定出的5个连翘PAO基因家族成员均具有特异性表达模式;在盐和干旱胁迫下5个连翘PAO基因家族成员的表达均受到诱导,可能参与连翘的盐胁迫及干旱胁迫响应调控,为深入探讨连翘PAO基因家族的功能奠定了基础。     

山茱萸转录因子CobHLH7基因的克隆及分析

目的克隆山茱萸转录因子Cob HLH7的c DNA序列。方法以转录组数据中unigenec15204_g1序列为参考,在其开放阅读框两端设计特异引物,提取山茱萸果实总RNA,并反转录成c DNA,以此为模板,经RT-PCR扩增、连接pMD19-T克隆载体并测序,获得Cob HLH7的cDNA序列。通过Protparatam、Prot Scale、SOPMA等软件,对其进行生物信息学分析。结果 Cob HLH7的cDNA长度为941 bp,编码266个氨基酸,其相对分子质量为29 220,等电点为6.32。经SOPMA在线软件预测,该蛋白为不稳定蛋白,其高级结构以α-螺旋和无规卷曲为主,含有少量的β-转角和延伸带。多序列比对和亲缘关系比较显示,Cob HLH7氨基酸序列与马铃薯和模式植物烟草的bHLH类转录因子亚家族的ILR3同源性较高。结论在首次对山茱萸叶片和果实转录组测序的基础上,对筛选并预测的可能与环烯醚萜苷合成相关的转录因子Cob HLH7进行克隆与生物信息学分析,为进一步研究其功能奠定基础。