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目的:检测半夏曲炮制过程中细菌、酵母菌、霉菌的菌落数量并定量分析其中4种优势微生物数量的动态变化,为研究半夏曲炮制机制提供实验依据。方法:参照《中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂》(第十册)制备半夏曲,取半夏曲炮制过程中0,30,60,90,120 h共5个不同时间点样品,分别用选择性培养基进行细菌、霉菌、酵母菌的培养和分离纯化,并进行菌落计数;应用荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术对枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis,宛氏拟青霉Paecilomyces variotii,丝衣霉菌Byssochlamys spectabilis,黑曲霉Aspergillus niger进行绝对定量,分别以枯草芽孢杆菌、宛氏拟青霉、丝衣霉菌、黑曲霉重组质粒为对照品,经倍比稀释后制作标准曲线,对半夏曲炮制至5个不同时间点(0,30,60,90,120 h)样品中的4种微生物进行定量分析。结果:半夏曲炮制过程中细菌数量少且变化平缓,而酵母菌和霉菌数量至发酵后期时迅速增加,至发酵结束时均 1×106CFU·m L~(-1)。枯草芽孢杆菌5个不同时间点样品中的拷贝数分别为3. 53×10~5,7. 56×10~4,1. 58×10~5,1. 90×10~6,1. 85×10~6copies·g~(-1);宛氏拟青霉的拷贝数为0,0,0,3. 45×10~7,4. 15×10~8copies·g~(-1);丝衣霉菌的拷贝数为0,0,0,1. 04×10~8,2. 28×10~8copies·g~(-1);黑曲霉的拷贝数为0,0,9. 48×10~5,1. 47×10~6,7. 56×10~6copies·g~(-1)。结论:半夏曲炮制过程中微生物菌群变化趋势可以用4种优势微生物的动态变化来反映,霉菌在半夏曲炮制中可能起重要作用。荧光定量PCR技术具有快速灵敏、重复性好和特异性高的优点,适用于半夏曲的炮制机制研究。 相似文献
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目的 筛选和鉴定淡豆豉炮制过程中产纤溶酶的优势菌株。方法 按《中国药典》2020年版制备淡豆豉;采用酪蛋白平板法和纤维蛋白平板法分别对淡豆豉炮制不同时间点样本中产纤溶酶的微生物进行初筛和复筛;将产纤溶酶微生物分别接种在特定的液体培养基中培养,获得纯种发酵液,用纤维蛋白平板法测定发酵液的纤溶酶活力;应用16S rDNA和18S rDNA通用引物分别对产纤溶酶细菌和真菌进行PCR扩增、对扩增产物进行测序,测序结果通过NCBI同源性比对、MEGA 4.1软件构建系统发育树进行分子生物学鉴定。结果 筛选获得3种产纤溶酶细菌,分别为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia、微球菌Micrococcus。纤维蛋白平板法测定纯种发酵液纤溶酶活力的结果显示,嗜麦芽窄食单胞菌所产纤溶酶活力最高,达527.49 IU/mL。结论 淡豆豉炮制过程中存在高产纤溶酶的优势菌株,淡豆豉的溶栓作用值得进一步研究。为揭示淡豆豉炮制中纤溶酶形成机制奠定基础。 相似文献
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目的考察从淡豆豉炮制过程中分离鉴定的枯草芽孢杆菌、鲑色锁掷酵母菌、黑曲霉菌、屎肠球菌、鸟肠球菌5株菌对产毒黄曲霉菌的拮抗能力,为探讨淡豆豉炮制过程中黄曲霉毒素的消长机制奠定基础。方法通过平板对峙法与十字交叉法检测5株菌及其代谢产物对产毒黄曲霉菌生长的影响;使用液质联用技术(liquid chromatograph mass spectrometer,LC-MS)考察5株菌对黄曲霉毒素B_1(aflatoxinB_1,AFB_1)的降解效果。结果 AFB_1在10~200ng/m L线性关系良好,r为0.999,低、中、高质量浓度的加样回收率为92.4%~97.2%,RSD为1.48%~2.35%(n=3)。其中鲑色锁掷酵母菌降解AFB_1效果最好,达43.65%,对产毒黄曲霉菌生长抑制作用最强的是鲑色锁掷酵母菌,达64.29%,发酵上清液对产毒黄曲霉菌生长抑制作用最强的是屎肠球菌,为29.63%。结论淡豆豉炮制过程中存在多种AFB_1拮抗微生物。 相似文献
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目的 考察从淡豆豉Sojae Semen Praeparatum(SSP)炮制过程中分离的15株产γ-氨基丁酸微生物对产毒黄曲霉菌的拮抗能力并筛选出具有抑制产毒黄曲霉菌生长和降解黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)的高效拮抗菌,探究高效拮抗菌发酵产物对黄曲霉毒素(aflatoxins)合成关键基因mRNA表达量的影响。方法 运用平板对峙法与十字交叉法检测15株产γ-氨基丁酸微生物及其发酵产物对产毒黄曲霉标准株(简称:产毒标准株)生长的影响,超高效液相色谱-串联质谱法(ultra performance liquid chromatography mass spectrometry,UPLC-MS/MS)检测15株菌对AFB1的降解效果,考察其对产毒黄曲霉菌的拮抗能力并筛选出高效拮抗菌;针对高效拮抗菌发酵产物分别运用菌丝干重法检测其对产毒标准株菌丝生长的影响,实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测其对黄曲霉毒素合成关键基因(aflR、aflD、aflM、aflP)mRNA表达的影响。结果 15株菌及其发酵产物对产毒标准株的生长抑制率分别在15.88%~56.05%和25.74%~52.12%,对AFB1降解率在2.74%~57.87%,表明它们对产毒黄曲霉菌均有一定的拮抗作用,并筛选出具有高效拮抗作用的黑曲霉菌Aspergillus niger(JC2)和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(Xd1)。当高效拮抗菌发酵产物加入量为2 000 µL时,JC2和Xd1对产毒标准株菌丝生长的抑制率分别为73.82%和63.34%,且能明显抑制黄曲霉毒素合成关键基因aflR、aflD、aflM、aflP的mRNA表达。结论 淡豆豉炮制中存在既能产γ-氨基丁酸又能明显抑制产毒标准株生长和产毒的拮抗菌,其拮抗作用可能通过抑制产毒标准株菌丝生长和毒素合成关键基因的mRNA表达。 相似文献
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目的对半夏曲中4种优势微生物建立快速、有效的荧光定量PCR检测方法。方法以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、宛氏拟青霉Paecilomyces variotii、丝衣霉菌Byssochlamys spectabilis、黑曲霉Aspergillus niger的重组质粒为标准质粒,设计特异性引物并进行特异性、灵敏性及重复性实验。结果 4种优势微生物的熔解曲线峰单一。枯草芽孢杆菌、宛氏拟青霉、丝衣霉菌、黑曲霉的最低检测限度分别为584、622、0.272、500拷贝/μL。不同质量浓度的标准质粒变异系数(CV)均小于5%。结论建立的枯草芽孢杆菌、宛氏拟青霉、丝衣霉菌、黑曲霉的荧光定量PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点,可用于发酵类中药中微生物的检测及定量。 相似文献
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目的 探讨短串联重复序列(STR)信息位点的峰高与峰下面积在异基因造血干细胞移植后嵌合状态判断中的作用,寻找适合于异基因造血干细胞移植状态判断的指标.方法 分别采集两名无关供者及M2患者及其HLA全相合供者两组血标本,以白细胞含量为依据制备不同比例混合血样,提取DNA,使用STR试剂盒,建立PCR扩增体系,在ABI3100仪上检测扩增片段,筛选得到理想的信息位点,获取其峰高及峰面积进行移植嵌合率的计算.结果 各筛选位点以峰高或面积得出的模拟嵌合率间差异均无统计学意义,且各位点模拟嵌合率与制备的浓度梯度之间的相关系数均在0.9965以上.结论 峰高或峰下面积均可作为嵌合状态的定量监控指标. 相似文献
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目的对淡豆豉炮制中影响γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)富集的主次因素进行初步研究,为揭示淡豆豉高含量GABA的形成机制奠定基础。方法用常规方法测定淡豆豉炮制过程中pH值、温度、水分、蛋白酶和谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)等指标的动态变化,用本实验室建立的柱前在线衍生法测定各样本GABA含量,通过SPSS统计软件对各指标与GABA进行相关性分析。结果相关性分析和多元回归分析结果表明,淡豆豉炮制过程中水分和酸性蛋白酶与GABA相关性系数分别为0.211和-0.340,P值分别为0.324和0.228,相关性较小且无统计学差异;比较回归系数绝对值的大小可知,其他各指标在GABA形成中的主次地位为pH值(-0.375)温度(-0.284)GAD(0.140)碱性蛋白酶(0.047)中性蛋白酶(-0.030),其中pH值、温度和中性蛋白酶与GABA具有负相关性,GAD活力和碱性蛋白酶与GABA存在正相关性。结论淡豆豉炮制过程中温度、pH值、GAD、中性及碱性蛋白酶是影响GABA形成的重要因素。 相似文献
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目的 研究RhD阴性个体基因多态性.方法 采用抗人球蛋白试验(IAT)确认RhD阴性个体;对RhD阴性个体再运用PCR-SSP方法分析其基因分布情况.结果 154例IAT确定为RhD阴性的个体中,86例所检测的外显子完全缺全(55.84%)、36例完整(23.38%)、32例部分缺失(20.78%);其检出DelRhD1227A、弱D15型、RHD-CE(2~9)-D、DVa(Has)、DVIⅢ等多种RhD阴性等位基因.结论 江西地区血清学RhD阴性人群中存在RHD基因且呈现多态性,提示可联合应用血清学和基因分型两种方法来检测D抗原. 相似文献